hsa_circ_0006411慢病毒载体的构建及验证

卢 韬 董学君

非编码RNA是指一类不能编码蛋白质的RNA类型(近年来发现有些非编码RNA也具有编码肽功能)，包括微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA等类型[1,2]。环状RNA是由mRNA前体反向剪接产生的闭合环状结构，虽然大多数不能编码蛋白质，但却可以通过一系列机制调节相关基因的表达，来发挥细胞学功能，在癌症中也具有重要的调控作用[3]。PIK3R1基因可编码p85a蛋白，作为磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路中PI3K的调节亚基，在诸如乳腺癌，宫颈癌等实体瘤中显著低表达，其可与PTEN结合，从而增强PTEN的脂质磷酸酶活性，发挥抑癌作用[4～6]。本研究发现，来源于PIK3R1母基因的环状RNA(hsa_circ_0006411)在多种实体瘤组织中低表达，为了研究其功能，拟构建其慢病毒载体，并验证实用性后，用于后续的细胞实验。

对象与方法

1.试剂与仪器：In-Fusion®HD 克隆试剂盒(日本TaKaRa公司)，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(美国Omega公司)，pLC5-ciR载体(广州吉赛公司)，RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国ExCell Bio公司)，脂质体2000(美国Invitrogen公司)；仪器主要有PCR仪(德国罗氏公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)和冷冻离心机等。

2.载体构建及测序鉴定：(1)目的片段扩增：设计带有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物，序列见表1，以人细胞混合样本cDNA为模板扩增环状RNA hsa_circ_0006411，目的片段在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳后，按照胶回收试剂盒操作说明回收纯化目的片段。(2) 目的片段与载体连接：分别向目的片段和载体pLC5-ciR中加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶，得到的产物连接成携带circ_0006411的pLC5-ciR表达载体。该表达载体转化感受态细胞，阳性菌落扩增后行PCR测序，与BLAST序列比对，看是否为目的hsa_circ_0006411 RNA序列；并比对测序得到的环化接头位点与circbase中的环化位点序列，看是否完全一致，测序引物列见表1。

3.hsa_circ_0006411载体的验证：293T细胞接种于6孔板中，当细胞80%汇合时转染，分成hsa_circ_0006411载体、PLC5-ciR空载体及对照组分别转染293T细胞，培养6h后换液，更换为完全培养基，40h以后观察细胞GFP的表达，并收集细胞，PCR扩增检测circ_0006411的表达情况，以GAPDH为管家基因，2-ΔΔCT表示irc_0006411的相对表达量，引物序列见表1。

表1 各基因引物表

结 果

1.载体测序结果：构建的PLC- hsa_circ_0006411载体经转化感受态细胞后，可在LA平板上检测出阳性菌落，该菌落PCR产物测序结果如图1，经BLAST序列比对后发现，与GenBank上的人hsa_circ_0006411序列完全一致，测序后得到的环化接头位点与circbase中的环化位点序列也完全一致(图1)，载体构建成功。

图1 hsa_circ_0006411部分测序图及环状位点测序图A.hsa_circ_0006411测序结果部分显示的图谱；B.hsa_circ_0006411环化位点处的显示图

2.转染293T细胞后hsa_circ_0006411表达量及测序结果：转染293T细胞后hsa_circ_0006411载体组、PLC5-ciR空载体及对照组相对表达量分别为9947.08±514.42、3.71±0.71和1.00±0.10，差异有统计学意义(图2)，其扩增曲线见图3；显微镜下可见在293T细胞中的绿色荧光蛋白的表达，表明hsa_circ_0006411载体可在293T细胞中稳定表达circ_0006411环状基因。

图2 转染293T细胞后基因表达情况

图3 hsa_circ_0006411 PCR扩增曲线黄色为GAPDH基因，其他为circ_0006411基因

讨 论

环状RNA在1976年首次在病毒中被发现[7]。作为非编码RNA群体的一个重要组成部分，其形成机制为线状mRNA前体物质反向剪接形成的环状结构，其5′和3′末端通过磷酸二酯键连接，而不形成悬空的自由末端，相对于线性结构而言，其环状结构使得其能够更加稳定的表达存在于组织、血液及其他体液中[8,9]。由于其非编码特性，在生物体生命活动，疾病发展过程中的作用一直以来都被忽视。直到近年来发现很多非编码RNA的重要调控基因表达的功能被提出，才对circRNA的研究重新引起重视。加上现代生物技术和研究工具的发展，越来越多的研究表明，circRNA在人类生命活动过程中的重要作用，目前而言主要体现在以下几个方面：①作为竞争性内源RNA(ceRNA机制，即竞争性结合miRNA，从而解除对与其结合的靶基因的抑制作用，来提高miRNA靶基因表达)来调控特异性基因的表达[10,11]；②与RNA结合蛋白相互作用来抑制或调控该蛋白的活性[12,13]；③通过顺式/反式作用与RNA直接结合来调控RNA的水平[14,15]；④可以作为模板翻译成多肽[16～18]。上述circRNA的稳定性特征及诸多功能，赋予其作为肿瘤发生、发展、诊断和治疗等多种路径分子的可能性，科学家的确发现其与肺癌、乳腺癌、泌尿生殖系统和消化系统等几乎所有癌种的密切关系。

本研究主要为肺癌相关的环状RNA的研究。前期研究发现，在肺癌组织中相对于癌旁组织低表达的circ_0006411,其母基因为编码PI3K信号通道中调节亚基P85a的基因PIK3R1，该基因在不同肿瘤中的表达高低具有明显的组织特异性，在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌和非小细胞肺癌中明显低表达，其可能主要是发挥抑制PI3K/AKT下游的动物雷帕素靶蛋白(mTOR)信号转导通路来抑制肿瘤的增殖，促进凋亡的作用[19,20]。今后拟进一步研究circ_0006411在非小细胞肺癌中的作用机制，需先构建该环状RNA的载体。本研究以慢病毒载体PLC5-ciR为工具，通过基因工程的手段，成功构建了携带该环状基因的慢病毒载体，并在293T细胞中能显著高表达，可以用于后续实验。