铁缺乏通过调节主动脉平滑肌表型转化促进主动脉夹层发生、发展

袁 顺 陈若诗 王志维

主动脉夹层(aortic dissection，AD)是一种心血管系统的危重急症，起病急骤，进展迅速，病情凶险，病死率极高。且AD主要发生于老年人中，在青年人中AD少见。主动脉壁由内膜、中膜和外膜共同构成。而整个主动脉夹层过程都发生在中层及以内的结构中：由内膜开始撕裂，在中膜向外延伸，并最终在接近外膜的位置发生撕裂。主动脉夹层的主要病理特征之一为主动脉中层退行性变 (aortic medial degeneration，AMD)。AMD的主要特征是主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)数目减少、表型转化、细胞外基质紊乱、弹性纤维紊乱断裂等[1]。VSMC表型由收缩型向分泌型转化。因此，研究探讨主动脉中膜VSMC表型转化的诱因及具体机制对于主动脉夹层的防治与治疗具有极其重要的作用。

铁元素参与许多重要蛋白质和酶的生物合成及活性，如血红蛋白、细胞色素和过氧化物酶等[2]。亚铁蛋白在多种生物活动如氧气运输、线粒体呼吸、中间产物和衍生物代谢、核酸复制和修复、细胞防御和细胞信号等中亦发挥着重要作用[3]。异常的铁代谢可导致一系列疾病。铁过载可导致肝脏损伤、胰岛素抵抗、心肌病、神经退行性疾病，并可直接损伤成骨组织和骨骼重塑[4～7]。缺铁 (iron deficiency，ID) 可引起更重的慢性心力衰竭症状和更严重的心血管后果等病理变化[8]。此外，妊娠期缺铁可损害胎儿脑发育和认知能力[9]。ID还可以通过诱导相关激素的产生从而影响骨骼健康[10]。此外，有研究指出，缺铁可增加肺血管对缺氧的敏感度，并导致肺动脉高压的发生[11]。老年人因胃肠道吸收功能减弱，机体营养状况较差，因而很多老年人都存在缺铁或亚临床缺铁状态。

目前关于铁元素与血管平滑肌细胞表型的研究在主动脉夹层相关领域中尚无报道，其具体发生机制也不明确。结合老年人中缺铁现象比较常见及AD多发生于老年人中，笔者检测了临床主动脉夹层患者的血清铁水平，发现其血清铁较同年龄段非AD患者显著降低(图1)。因此，结合铁元素生物学功能，笔者初步推测，缺铁可能通过影响主动脉血管平滑肌细胞的表型，导致主动脉中膜退行性变，从而促进主动脉夹层的发生。

材料与方法

1.采集人体血管标本：本研究选择2018年2月～2019年2月在武汉大学人民医院心血管外科被确诊为Stanford Ⅰ型夹层并行全主动脉弓置换的患者6例为实验组，患者年龄60～73岁，平均年龄为65.9岁，男女性别比为1∶1。患者均经CTA检查确诊为AD，且夹层的撕裂口位于升主动脉。所有实验组患者术前均无冠心病、外周血管疾病、关节炎及膜性肾病。患者均在入院后行急诊手术，术中取病变的血管组织。选择同期在武汉大学人民医院行心脏移植手术的患者6例为对照组，选取的移植患者均无大血管疾病。夹层主动脉组织在手术过程中取出并于冰中转送至实验室进行处理。术前所有试验方案均已告知家属，并签署知情同意书，且本部分试验已经由武汉大学伦理学委员会审批同意。两组患者的血管标本取出后，立即进行处理并分装，一部分冻存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋以行后续检测。另外，采集23例主动脉夹层患者的血清和23例笔者所在科室非夹层患者的血清，并对血清中的铁含量进行检测。

2.实验动物及分组：选择3周龄的野生型小鼠24只，随机分为4组，每组6只。对照组喂普通小鼠维持饲料；β氨基丙腈酯(BAPN)组于第3周开始喂含2.5g/kg BAPN 小鼠维持饲料；ID组第3周起喂含5mmol/L铁的维持饲料[10]；ID+BAPN组(IB组)于第3周开始喂含2.5g/kg BAPN及5mmol/L铁的维持饲料，各组均持续喂养4周。若小鼠在AD造模过程中死亡则立即解剖(不另外补充小鼠)以明确死因，用4%多聚甲醛保存血管标本。各组存活小鼠在造模第4周，经戊巴比妥麻醉后，游离小鼠主动脉，采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后行后续检测。

3.普鲁士蓝染色观察血管中铁含量的变化：采用普鲁士蓝染色法测定主动脉铁含量。石蜡切片脱蜡至水。1∶1比例混合亚铁氢化钾溶液和盐酸溶液制备普鲁士蓝染液染，染色1h后蒸馏水洗两次；核固红染料染核1～5min，自来水下冲洗，脱水封片，并在光学显微镜下观察。

4.HE染色和EVG染色观察血管形态学改变：(1)HE染色：石蜡切片脱蜡至水，自来水洗；苏木精染色3～5min，盐酸水溶液分化，氨水水溶液返蓝，水洗；入伊红染液中染色5min；脱水封片；显微镜观察。(2)EVG染色：石蜡切片脱蜡至水，自来水洗；乙醇苏木精∶三氯化铁∶碘液=5∶2∶2混合成EVG染液，切片入EVG染液染30min，自来水冲洗；三氯化铁分化液分化，自来水洗，如此反复并在显微镜下控制分化程度，至弹力纤维呈紫黑色，背景呈灰白色近无色；将饱和苦味酸与丽春红9∶1混合成VG染液复染1～3min，快速水洗，脱水封片；显微镜观察。

5.免疫组织化学检测血管相关蛋白表达变化情况：将切片置于60℃恒温烘箱中烤片、融蜡1h，然后将标本置于二甲苯溶液中进一步脱去残余石蜡，其后分别将切片置于100%、95%、85%、75%和50%乙醇、蒸馏水中水化。PBS漂洗2次，每次5min；切片于0.1%Triton溶液处理15min，PBS漂洗3次，每次5min；将切片置于pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中，微波修复；待修复液自然冷却后，于3% H2O2溶液中浸泡10min，封闭组织标本中的过氧化物酶，山羊血清封闭组织切片中的非特异性抗体，一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5min，二抗常温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，后用氨基联苯胺于显微镜下显色，苏木精对比染色，盐酸乙醇脱色，氨水返蓝。脱水封片，显微镜下观察拍照。

6.Western blot法检测相关蛋白表达：取绿豆大组织标本，加入适量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液用以提取总蛋白，蛋白样品冰上超声碎裂；所得样品于冷冻离心机中以4℃ 12000r/min离心20min，取上清；根据蛋白裂解液RIPA 的体积，以适当的比例加入蛋白上样缓冲液混匀，100℃恒温浴10min，所获蛋白样本冻存于-80℃。每孔蛋白上样量为20μg，电泳电压90V，电流40mA，以12%浓度聚丙烯酰胺凝胶进行Western blot法电泳。在电流200mA，电压100V 条件下电转1h45min。以肌动蛋白(actin)为内参，以羊抗鼠、羊抗兔HRP二抗显影，扫膜并分析。

结 果

1.AD组和对照组主动脉病理变化及铁含量比较：笔者纳入了23例AD患者和23例非AD患者进行血清铁浓度测定，通过对临床患者的血清学结果分析显示，AD组患者血清铁浓度为13.79±1.50μmol/L，对照组血清铁浓度为18.90±1.71μmol/L，P=0.029(图1A)。EVG染色结果显示，AD组弹力纤维断裂明显较对照组增多(图1中B、C)，AD组血管组织切片病理特征符合AD组织病理变化。此外，笔者还用普鲁士蓝染色验证组织内铁含量，结果发现AD组主动脉中铁含量较对照组明显减低(图1中D～F)。

图1 AD组和对照组主动脉病理变化及铁含量变化(×40)A.AD患者与非AD患者血清铁含量；B.供体主动脉组织EVG染色；C.AD患者主动脉组织EVG染色；D.供体主动脉组织普鲁士蓝染色(铁染色)；E.AD患者主动脉组织普鲁士蓝染色(铁染色)；F.供体主动脉与AD患者主动脉组织普鲁士蓝染色阳性率情况比较

2.AD组和对照组主动脉表型变化情况：免疫组化染色结果显示，AD组的收缩表型相关蛋白α-SMA表达较对照组明显降低(图2中A～C)，而分泌表型相关蛋白OPN表达升高(图2中D～F)，P<0.05。即AD患者主动脉的收缩能力降低，其对外源性损伤的应变能力和抗损伤能力降低。

图2 AD组和对照组主动脉各蛋白表达情况(免疫组化染色，×40)A.供体主动脉组织α-SMA表达情况；B.AD患者主动脉组织α-SMA表达情况；C.供体主动脉组织与AD患者主动脉组织α-SMA表达情况比较；D.供体主动脉组织OPN表达情况；E.AD患者主动脉组织OPN表达情况；F.供体主动脉组织与AD患者主动脉组织OPN表达情况比较

3.各组造模小鼠生存率比较：在给药第21天，IB组小鼠死亡5只存活1只，BAPN组小鼠死亡3只存活3只，WT 组和ID组小鼠均存活。IB组死亡率明显高于BAPN 组(83.3% vs 50.0%,图3)。

4.各组小鼠主动脉病理变化及铁含量变化情况：普鲁士蓝染色结果显示BAPN组较对照组、ID组较对照组及IB组较BAPN组小鼠主动脉中铁含量降低(图4中A～E)。EVG染色结果显示，ID组主动脉较对照组弹力纤维断裂略增多，BAPN组主动脉较对照组主动脉弹力纤维断裂明显增多，IB组较BAPN组弹力纤维断裂增多，即IB组小鼠主动脉的损伤较BAPN组更为严重(图4中F～I)。

图3 各组小鼠生存曲线

图4 各组小鼠造模后主动脉结构及主动脉组织中铁含量的情况(×40)A.对照组小鼠主动脉普鲁士蓝染色；B.缺铁组小鼠主动脉普鲁士蓝染色；C.BAPN组小鼠主动脉普鲁士蓝染色；D.IB组小鼠主动脉普鲁士蓝染色；E.各组小鼠主动脉普鲁士蓝染色阳性率情况比较；F.对照组小鼠主动脉EVG染色；G.缺铁组小鼠主动脉EVG染色；H.BAPN组小鼠主动脉EVG染色；I.IB组小鼠主动脉EVG染色；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

5.各组小鼠主动脉表型变化情况：免疫组化染色结果显示，BAPN组α-SMA表达显著下调，低铁干预使得α-SMA的表达进一步降低(图5中A～E)。此外，BAPN组OPN表达显著升高，低铁干预后亦可增加OPN的表达进一步上调，而IB组较BAPN组无明显改变(图5中F～J)。

讨 论

受早年的医学检验技术水平的限制，AD于人群中的检出率及发现率低。随着现代医学检验技术水平尤其是影像学技术的进步及普及，以及人们对健康状况重视程度的升高，AD的检出率越来越高，且多出现于老年人中。然而，AD的确切发病机制仍不清楚。因此，阐明AD发生的原因可能对AD的预防、诊断、治疗和预后具有重要意义。近年来有研究表明，ID可通过影响线粒体呼吸过程，从而降低心肌细胞的收缩功能，从而导致心力衰竭的发生[12]。本研究发现，ID可能通过影响线粒体功能，使得ATP合成显著降低，细胞活性氧水平升高，导致平滑肌细胞发生表型转化导致VSMC功能障碍，从而导致AMD乃至AD发生。

图5 各组小鼠主动脉各蛋白表达情况(免疫组化染色，×40)A.对照组小鼠主动脉α-SMA表达情况；B.缺铁组小鼠主动脉α-SMA表达情况；C.BAPN组小鼠主动脉α-SMA表达情况；D.IB组小鼠主动脉α-SMA表达情况；E.各组小鼠主动脉组织α-SMA表达情况比较；F.对照组小鼠主动脉OPN表达情况；G.缺铁组小鼠主动脉OPN表达情况；H.BAPN组小鼠主动脉OPN表达情况；I.IB组小鼠主动脉OPN表达情况；J.各组小鼠主动脉OPN表达情况比较；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

铁元素参与构成机体多种重要的蛋白，因而铁稳态对机体、细胞乃至细胞器发挥正常的生理功能具有重要的作用[3]。外源性刺激可以诱导主动脉平滑肌细胞发生表型转化。正常主动脉组织中血管平滑肌细胞多为分化型，即收缩表型，其特点为细胞增殖能力弱，分泌的细胞外基质量极少，并表达特定的收缩蛋白。当血管受损时，这些细胞转化为合成表型，在该表型下细胞发生增殖并向损伤部位迁移[13]。此外，有研究结果表明，能量释放与线粒体铁浓度梯度密切相关，说明铁与能量代谢密切相关，而线粒体功能障碍与早期VSMCs表型转化有关[14，15]。此外，线粒体可通过多种分子机制致使ROS产生，如呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、NAD(P)H/NAD(P)+等的损伤反应诱导ROS产生，过量的ROS可诱导VSMCs从收缩表型转化为分泌表型，使得VSMCs收缩能力下调，从而导致血管张力发生改变，并可能因此导致AD的发生[16，17]。因此笔者推测，ID可能通过诱导VSMCs 表型转化，从而导致AMD及AD的发生。

为探讨表型转化在ID诱导AD发生中的作用，笔者构建了小鼠AD模型，并在常规AD造模基础上，对小鼠饲料增加了ID处理，小鼠结果显示IB组小鼠生存周期较BAPN组明显降低，AD发生率明显升高。免疫组化染色结果显示，IB组较BAPN组小鼠主动脉的VSMCs表型由收缩型向分泌型转化更明显，单ID处理的小鼠亦出现出少许表型转化。当然本研究具有一定的缺陷性。为使结果更具有可信性，还可通过限制小鼠体内线粒体功能进行进一步验证。同时，笔者诱导小鼠AD模型时采用的是幼年小鼠，与临床上老年人AD多发的机体状态可能存在一定的差异。此外，BAPN诱导小鼠AD发生较血管紧张素泵诱导的AD模型具有一定的局限性，需更多的体内实验多方验证。

综上所述，本研究发现，ID通过诱导VSMCs表型转化，从而在导致AMD和AD的发生、发展中存在一定的作用。同时，临床上ID及AD均在老年人群中多发。铁元素为机体的一种重要的微量元素，且该元素在体内的水平在临床上极易检测，且机体内铁水平作为一种AD可能的诱导因子，ID可诱导更严重的AMD现象，及时发现亚临床缺铁现象并即使补充也许可在一定程度上预防AD的发生。由于未进行体内实验的研究，因而笔者推测，在尚未发生AMD时或发生表型转化初期补充铁含量也许在预防及改善早期AD的发生、发展中具有一定的作用。