应用Discovery Studio（TOPKAT）软件预测糖抑制PhIP过程中新产物的毒理学性质

韩中惠 王晓敏 张 燕 刘 冰 王 硕*

（1 齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院 济南250353 2 天津科技大学食品工程与生物技术学院 食品营养与安全国家重点实验室 天津300457 3 南开大学医学院 天津市食品科学与健康重点实验室 天津300071）

杂环胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白质的食物在热加工过程中形成的具有多环芳香族结构的致癌、致突变的一类化合物[1-2]。这些杂环胺具有增加罹患结肠癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的风险[3-4]。鉴于杂环胺对健康的危害，研究者通过外源添加抑制剂以减少杂环胺的形成。目前研究表明，多酚类化合物[5]、维生素[6]、金属阳离子[7]和酰胺类化合物[8]等物质都能显著减少食品中杂环胺的含量。

研究人员发现，不同种类的糖可有效降低杂环胺中2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4，5-b]pyridine，PhIP）的形成[9-11]。本课题组前期研究揭示了糖抑制PhIP 形成的可能作用机制，糖（葡萄糖、果糖和乳糖等）可通过热降解形成α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮等），而α-二羰基化合物可分别与PhIP 的前体物发生相应的化学反应形成新的产物，或者直接与PhIP反应形成新的产物，从而减少食品体系中PhIP 的含量[12]。从食品安全的角度考虑，这些新形成的产物是否安全，决定了PhIP 减控后食品的安全性，因此，针对新产物毒理学性质的研究具有重要意义。然而，由于加工食品组分的复杂性，对大量制备新产物进行毒理学评价的动物实验提出了巨大挑战，因此借助计算机软件模拟预测新产物的毒性，十分必要。

Discovery Studio 中的TOPKAT 模块软件可以通过对化学物质结构参数的计算，预测小分子化合物的毒性。TOPKAT 模块软件目前主要用于药物设计研发中复杂成分的毒性预测以及市售药品中的微量成分的毒性预测。美国食品和药物管理局（Food and drug administration，FDA）和加拿大药品评审委员会均利用这类数据库帮助判断相关化合物的毒性[13]。与传统的毒理学试验相比，采用TOPKAT 模块软件进行毒性预测具有分析速度快，成本低，不依赖试验条件等优点。TOPKAT 模块软件预测数据的准确率超过85%[14]。本研究采用Discovery Studio （TOPKAT） 软件，对糖抑制PhIP 形成过程中产生的相关新产物进行毒性预测，为全面评价PhIP 减控后的食品安全提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及设备

ChemDraw 12.0 软件，美国Cambridge Soft 公司；Discovery Studio 分析软件，美国BIOVIA 公司；Precision T7810 工作站，美国Dell 公司。

1.2 毒性计算方法

用ChemDraw 12.0 软件绘制相关化合物的结构式，生成Discovery Studio（TOPKAT）软件可以识别的格式（sdf 格式）；将化合物结构式导入Discovery Studio 软件，生成分子二维（2D）结构；选择要分析的化合物结构式，再选择相关的毒理学评价指标后进行分析[15]。本研究选择的毒理学评价指标为致突变性（Ames test）、潜在发育毒性、大鼠口服半致死量（Median lethal dose，LD50）、大鼠吸入半致死浓度（Median lethal concentration，LC50）、大鼠长期口服最低毒副反应水平和大鼠皮肤致敏性。

1.3 预测结果的分析判定

致突变性（Ames test）、潜在发育毒性（DTP）和皮肤致敏性的预测结果为概率值，当预测值为0.000～0.300 时，被预测的化合物具有毒性的概率低，且可能会在实际测定中产生阴性结果；当预测值大于0.300 或小于0.700 时，被预测的化合物所具有的毒性不确定；当预测值大于0.700 时，被预测的化合物具有毒性的概率高，且可能会在实际测定中产生阳性结果[16]。大鼠口服LD50毒性范围的定义为：LD50>15 g/kg，无毒性；5 g/kg

2 结果与分析

2.1 糖抑制PhIP 形成过程中的新产物

食品体系中的糖抑制PhIP 的形成，可以通过糖形成的活性中间体α-二羰基化合物中的丙酮醛分别与形成PhIP 的前体物肌酐或PhIP 发生反应，形成新化合物[12]。糖在抑制PhIP 形成的过程中还会形成其它的α-二羰基化合物，例如：乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮。由于α-二羰基化合物是一类具有类似化学性质的物质，根据它们新产生化合物的反应形成机理，乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮也可分别与肌酐（如图1）或PhIP（如图2）发生反应生成相应的新化合物。图1中α-二羰基化合物的活性基团羰基与肌酐的活性基团亚甲基或与氨基分别通过羟醛缩合和羰胺缩合反应形成相应的反应产物。图2是α-二羰基化合物的活性基团羰基与PhIP 的活性基团亚甲基发生羰胺缩合反应形成相应的产物。

图1 乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮与肌酐反应产物的形成Fig.1 Formation of the reaction products of glyoxal，diacetyl and 3-deoxyglucosone with creatinine

图2 乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮与PhIP 反应产物的形成Fig.2 Formation of the reaction products of glyoxal，diacetyl and 3-deoxyglucosone with PhIP

2.2 新产物的毒理性质预测

采用Discovery Studio（TOPKAT）软件分别对丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮与肌酐或PhIP 反应形成相应新化合物的毒理学数据进行预测，并与PhIP 的毒理学数据进行比较分析。

表1显示了PhIP 的相关毒性预测结果，PhIP致突变性的预测数值为1.000，说明PhIP 具有较高的致突变性，与PhIP 的毒理学实验数据报道一致[18]，说明对于该化合物的毒性预测准确。PhIP 潜在发育毒性的预测数值为0.000，表明PhIP 不具有潜在发育毒性。大鼠口服PhIP 的LD50值为9.5 mg/kg，属于毒性范围。PhIP 对于大鼠吸入LC50和大鼠长期口服最低毒副反应水平最小量分别为859.1 mg/kg 和43.2 mg/kg。PhIP 使皮肤致敏性的结果为0.000，表明不具有使皮肤致敏的可能性。

表1 PhIP 的相关毒性Table 1 Related toxicity of PhIP

表2显示了丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮与肌酐由羟醛缩合和羰胺缩合反应途径形成相关产物的毒理学评价指标数据。从表中可以看出这8 种产物致突变性和潜在发育毒性的数值均为1.000，这表明它们致突变性和潜在发育毒性的结果均呈阳性，这些产物致突变性的结果与PhIP 致突变性的结果相同，没有发生变化，而它们的潜在发育毒性与PhIP 相比毒性增强。这8种产物的大鼠口服LD50值分别在轻度毒性、实际无毒性和无毒性的范围，它们均比PhIP 的大鼠口服LD50量低，表明这些产物半致死量的毒性比PhIP 弱；其中3-脱氧葡萄醛酮和肌酐经羟醛缩合反应途径形成产物的半致死量值最大为85.6 g/kg，表明该产物在大鼠口服LD50评价中表现的毒性最小。在大鼠吸入LC50的评价指标中，这8 种产物的半致死浓度均比PhIP 的859.1 g/m3·H 低，表明8 种产物在这个评价指标中的毒性均比PhIP强。这些产物（除丙酮醛和肌酐经羰胺缩合反应途径形成的产物外） 的大鼠长期口服最低毒副反应水平的量均比PhIP 小，表明除个别产物外，大部分产物的形成使它的毒性增强。在皮肤致敏性的评价指标中，通过数据分析表明这些反应产物不具有使皮肤致敏的可能性，与对PhIP 预测的结果相同，虽然3-脱氧葡萄醛酮和肌酐经羟醛缩合途径形成的产物使皮肤致敏性的预测结果为0.255，但是该值仍处在不具有致敏性的范围内。此外，在致突变性、潜在发育毒性、大鼠吸入LC50和大鼠皮肤致敏性这4 个毒理学评价指标中，经羟醛缩合和羰胺缩合途径形成产物的毒性分别与PhIP 对比结果都一致，这表明在一定程度上这些产物之间的毒性性质相似。

表2 反应产物（肌酐与α-二羰基化合物）的相关毒性Table 2 Related toxicity of reaction product （creatinine and α-dicarbonyl compounds）

α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、丁二酮和3-脱氧葡萄醛酮）与PhIP 的4 种反应产物的相关预测毒性结果见表3，结果显示α-二羰基化合物与PhIP 反应产物致突变性的结果为阳性，这与预测PhIP 致突变性的结果相同，表明致突变的毒性没有发生变化。对这4 种反应产物的潜在发育毒性和皮肤致敏性预测的结果均为阴性，这与PhIP的结果相同，表明潜在发育和皮肤致敏的毒性也没有发生变化。这4 种产物的大鼠口服LD50（mg/kg）量分别为16.2，20.0，16.4，275.9 mg/kg，此结果明显高于PhIP（9.5 mg/kg）的LD50量，说明相比PhIP 来说，这4 种产物的毒性降低，然而还在毒性或中度毒性范围内，其中PhIP 与3-脱氧葡萄糖醛酮的产物毒性最小。在大鼠吸入LC50方面，这些产物（除PhIP 与乙二醛反应产物）表现出的毒性均比PhIP 低。然而，这4 种产物的大鼠长期口服最低毒副反应水平量均高于PhIP，说明在大鼠长期口服最低毒副反应水平上表现出毒性降低现象。

表3 反应产物（PhIP 与α-二羰基化合物）的相关毒性Table 3 Related toxicity of reaction product （PhIP and α-dicarbonyl compounds）

3 讨论

通过TOPKAT 软件预测分析表明，在致突变性（Ames test）评价中，α-二羰基化合物与肌酐的反应产物和α-二羰基化合物与PhIP 的反应产物结果相同，均具有致突变毒性，与PhIP 所具有的毒性相比没有发生变化；在潜在发育毒性评价中，α-二羰基化合物与肌酐的反应产物所具有的毒性与PhIP 相比增强，而α-二羰基化合物与PhIP 的反应产物与PhIP 的结果相同，毒性没有发生改变；在大鼠口服LD50和大鼠长期口服最低毒副反应水平评价中，绝大部分α-二羰基化合物与肌酐反应产物的毒性均比PhIP 强，而α-二羰基化合物与PhIP 的反应产物所表现的毒性比PhIP 弱；在大鼠吸入LC50评价中，大部分产物的毒性均比PhIP 的毒性强；在皮肤致敏性评价指标中，α-二羰基化合物与肌酐的反应产物和α-二羰基化合物与PhIP 的反应产物均不具有皮肤致敏毒性。从这3 种反应途径形成的产物来看，每个途径形成产物之间的结果与PhIP 对比的结果整体一致，说明在一定程度上这一类的化合物毒理学性质相似。其毒理学性质相似可能是α-二羰基化合物与于肌酐/PhIP 形成产物的化学结构决定的，不同途径形成产物的化学结构具有较多的相同官能团，所以使同一途径形成的产物具有类似的活性。

综合以上分析结果发现，糖抑制PhIP 产生过程中的新化合物仍存在不同程度的毒性。尽管糖可以抑制杂环胺PhIP 的产生，减少杂环胺本身的危害，然而由于伴随产物的危害仍存在，并不能完全保障整体食品的安全性。对糖抑制杂环胺PhIP产生过程中新产物的毒性研究结果仅为其毒理学特性评价提供依据，要准确评价新产物的毒理性质，仍需全面系统的进行毒理学实验评估。