镇江香醋对非酒精性脂肪肝病小鼠的保护作用及机制

朱淑云 杨 靖 邵 锋 董 英 余永建

（1 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江212013 2 江苏恒顺集团有限公司 江苏镇江212143）

近年来随着人们生活方式的改变，能量和膳食脂肪摄入的增加，非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病人数逐年增加，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。更重要的是NAFLD 患者的年龄分布在向低龄化发展，在肥胖儿童中NAFLD 的发病率高达70%以上[1-3]。NAFLD 的发病机制与脂代谢紊乱、胰岛素抵抗（IR）、炎性反应和氧化应激等因素密切相关，现在临床上尚无针对NAFLD 安全有效的药物[4-6]。目前，NAFLD 的治疗主要包括调整生活方式 （营养和运动），增加胰岛素敏感性，减轻炎性反应以及保护肝细胞的药物疗法，然而相关药物缺乏较理想的疗效，并且往往成本较高，有较多的副作用。近年来一些天然活性物质对NAFLD 的作用逐渐引起了人们的关注[7-10]。镇江香醋（Zhenjiang aromatic vinegar，ZAV）具有显著的抗氧化活性，其抗氧化活性成分包括黄酮类、多酚类、维生素、皂苷类和活性多肽等物质[11-13]。另有研究发现，镇江香醋具有保护肝脏的作用，香醋中的活性成分对肝脏组织损伤有修复作用，可以提高肝脏解毒功能，促进其新陈代谢[14]。体外实验表明，食醋中的川芎嗪和外环二肽具有较好的降血脂功效[15]。NAFLD 的发病机制与肥胖和氧化损伤密切相关，而镇江香醋是否对NAFLD 具有保护作用尚未见文献报道。鉴于此，本试验通过高脂饮食建立NAFLD 小鼠模型，研究镇江香醋对NAFLD 小鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

2月龄雄性ICR 小鼠40 只，江苏大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2013-0011，所有小鼠均饲养于江苏大学实验动物中心动物房内。

镇江香醋（ZAV），镇江恒顺醋业有限公司。参考文献[12]的方法将香醋在60 ℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，其中浓缩醋的固形物含量为48.52%，总酚质量浓度为12.21 mg/mL，总黄酮质量浓度为6.42 mg/mL。

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA）等试剂盒，南京建成生物工程研究所；胰岛素ELISA 试剂盒、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒、白介素6（IL-6）ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 设备与仪器

T8 电动均浆器，德国IKA 公司；L500 离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；AU2700 全自动生化分析仪，日本Olympus 公司；Multiskan GO全波长酶标仪，美国Thermo 公司；Ti-E 倒置荧光显微镜，日本Nicon 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 实验动物分组 将小鼠按体质量随机分为4 组：正常组、模型组、ZAV 低剂量组、ZAV 高剂量组，每组10 只，经1 周适应性饲养后，正常组小鼠喂养普通饲料，模型组小鼠喂养高脂饲料（70.5%普通饲料，10%猪油，10%蛋黄粉，8%蔗糖，1.5%胆固醇），ZAV 组小鼠喂养高脂饲料，分别每天灌胃1.2 g/（kg·d）和2.4 g/（kg·d）的ZAV，正常组和模型组小鼠灌胃等量蒸馏水。试验期间小鼠自由饮水、自由采食，每天固定时间灌胃，连续饲喂8 周。试验结束后，采血，引颈处死小鼠，迅速取肝组织和脂肪组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸去水分后，以电子天平准确称取质量，置洁净塑料袋中密封，超低温保存。

1.3.2 指标检测 血清中的TG、TC、HDLC、LDLC和葡萄糖由全自动生化分析仪测定；FFA、SOD、CAT、GSH、MDA、TNF-α 和IL-6 等指标按试剂盒说明书进行测定。根据血清葡萄糖和血清胰岛素水平计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。

HOMA-IR=空腹葡萄糖水平 （mmol/L） ×空腹胰岛素水平（mIU/L）÷22.5

1.3.3 肝组织形态学检测 取小鼠肝组织用10%中性福尔马林固定，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。

1.4 数据统计分析

各组数据结果以x¯±SD （平均值±标准差）表示，采用SPSS17.0 数据分析软件进行方差分析，统计组间差异，P ＜0.05 认为组间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 ZAV 对小鼠体质量和腹部及附睾脂肪质量的影响

由表1可知，试验前各组小鼠的体质量没有显著性差异（P＞0.05），试验后模型组小鼠的体质量显著高于正常组（P<0.05），ZAV 可以显著降低小鼠的体质量，使其达到正常组的水平；模型组小鼠的腹部脂肪和附睾脂肪质量也显著高于正常组（P<0.05），说明高脂饮食使小鼠体内脂肪含量明显增加，ZAV 可以显著抑制小鼠脂肪含量的增加，高剂量组优于低剂量组。

表1 ZAV 对小鼠体质量和腹部及附睾脂肪质量的影响（n=10）Table 1 Effect of ZAV on body weight，abdominal and epididymal fats in mice （n=10）

2.2 ZAV 对小鼠血清和肝脏中脂类水平的影响

众所周知，脂代谢紊乱是引起NAFLD 的重要因素，而长期大量的高脂饮食必然引起脂肪合成加快和血脂升高，而TC 或TG 升高会导致体内脂质代谢异常。另外，FFA 增加被认为是导致NAFLD 的重要起始因子，过量的FFA 会促使脂肪肝的形成，FFA 还可加重胰岛素抵抗[16]。ZAV 对小鼠血清和肝脏中脂类水平的影响见表2。

表2显示，与正常组比较，模型组小鼠血清和肝脏中的脂类都显著升高（P ＜0.05），表明高脂饮食导致小鼠体内脂代谢紊乱，灌胃8 周后，ZAV 可以显著降低血清TG 和FFA 水平（P ＜0.05），ZAV高剂量组还可以显著降低血清LDL-C 水平和肝脏中TC 和TG 水平（P ＜0.05），而ZAV 组血清中的TC 与模型组无显著性差异（P ＞0.05）。HDLC可以将外源性胆固醇由组织细胞运到肝脏代谢，其可以清除血管内壁沉积的胆固醇，防止心脑血管疾病的发生，多数研究表明NAFLD 小鼠的HDLC 水平均下降[17-18]，而本试验中NAFLD 小鼠血清的HDLC 升高，可能由于大量外源性胆固醇的摄入促进了HDLC 水平的升高，具体原因有待进一步研究。表2结果表明ZAV 可以降低NAFLD 小鼠血清和肝脏中的脂质水平，可以在一定程度上减缓NAFLD 的发生。

表2 ZAV 对小鼠血清和肝脏中脂类水平的影响（n=10）Table 2 Effects of ZAV on the lipid levels in serum and liver of mice （n=10）

2.3 ZAV 对小鼠血糖、胰岛素和HOMA-IR 的影响

胰岛素是一种降血糖激素，可以促进脂肪合成，抑制脂肪分解，过量的胰岛素会引起肝内脂肪堆积，导致脂肪肝的形成。而肝脏脂肪的堆积又可以进一步诱发加重胰岛素抵抗，胰岛素抵抗在NAFLD 发展中起首要作用，是导致肝损伤的首要因素，因此改善胰岛素抵抗是治疗NAFLD 的关键因素之一，而增强胰岛素的敏感性是改善胰岛素抵抗的首要措施[19-20]。ZAV 对小鼠血糖、胰岛素和HOMA-IR 的影响见表3。

表3 ZAV 对小鼠血清中葡萄糖、胰岛素和HOMA-IR 的影响（n=10）Table 3 Effects of ZAV on glucose，insulin and HOMA-IR in serum of mice （n=10）

由表3可见，高脂饲料诱导模型组小鼠的血糖和胰岛素水平较正常组显著升高（P<0.05），小鼠产生了明显的胰岛素抵抗。灌胃8 周后，与模型组比较，ZAV 的干预显著降低了小鼠的血糖和胰岛素水平，改善了小鼠的胰岛素抵抗。也有研究发现食醋可以延缓血糖的上升，从而使胰岛素的分泌减少，并进一步控制脂肪的合成，这可能与食醋中含有较多的有机酸有关[21-22]。

2.4 ZAV 对小鼠肝组织SOD 和CAT 活性及GSH 和MDA 含量的影响

氧化应激在NAFLD 的发展中起到重要作用，肝脏中的脂质过氧化是活性氧的重要来源，而过量的活性氧会进一步加重肝细胞的氧化应激。SOD 和CAT 活性及GSH 含量可以反应出机体的抗氧化能力，MDA 是脂质过氧化产物，可反应组织氧化损伤程度[23-24]。本试验结果表明，模型组小鼠肝脏SOD 和CAT 的活性及GSH 含量显著降低，而MDA 含量显著增加，说明NAFLD 小鼠肝脏的抗氧化能力及对自由基的清除能力下降，脂质过氧化损伤增加。ZAV 可显著提高小鼠肝脏的SOD 和CAT 活性及GSH 含量，并降低MDA 含量。提示ZAV 可以提高机体的抗氧化能力，对机体脂质过氧化有一定的抑制作用。许多研究也证实了食醋具有很强的抗氧化能力[11-13]，这与其含有较多的抗氧化物质，如黄酮、多酚及类黑素等有关[25-27]。

表4 ZAV 对小鼠肝组织SOD 和CAT 活性及GSH、MDA 含量的影响（n=10）Table 4 Effects of ZAV on activities of SOD and CAT，and levels of GSH and MDA in liver tissue of mice （n=10）

2.5 ZAV 对小鼠血清中TNF-α、IL-6 和脂联素水平的影响

炎性因子在NAFLD 的发生发展中起着重要作用，而TNF-α 和IL-6 是体内两种非常重要的炎症细胞因子，它们既能直接损伤肝细胞，又能引起胰岛素抵抗，从而促进脂肪肝的形成[28-29]。而脂联素是一种抗炎细胞因子，它可以通过抑制脂肪生成，提高线粒体内游离脂肪酸的氧化，增强胰岛素敏感性，从而降低肝脏脂质的累积，减轻炎性因子的释放[30]。

图1 ZAV 对小鼠血清中TNF-α、IL-6 和脂联素水平的影响（n=10）Fig.1 Effects of ZAV on serum TNF-α，IL-6 and adiponectin levels （n=10）

由图1可知，NAFLD 小鼠血清中的炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 显著升高，脂联素水平显著降低，而ZAV 可以降低TNF-α 和IL-6 水平，升高脂联素水平，提示ZAV 可以减轻NAFLD 小鼠的炎症反应，对脂肪肝小鼠有一定的保护作用。这可能与ZAV 能够减轻肝组织脂肪的累积，具有较强的抗氧化活性有关。

2.6 ZAV 对小鼠肝组织形态的影响

由图2可见正常组小鼠的肝细胞结构完整、清晰，肝细胞大小均一，无脂肪变性。模型组小鼠肝细胞形态发生了明显变化，大多数肝细胞肿胀，呈弥漫性脂肪变性，有的肝细胞呈气球样变性，而NAFLD 的主要特征是肝细胞脂肪变性和肝脂肪的异常累积，由此可以判断高脂饮食导致了小鼠脂肪肝的形成，而ZAV 组小鼠肝组织结构完整，肝细胞脂肪变性程度较模型组有较大的改善，肝细胞基本恢复了正常的形态结构，说明ZAV 可以减少NAFLD 的发生，这与其具有降脂、减重、抗炎、抗氧化的活性密切相关。

图2 ZAV 对小鼠肝组织形态的影响（200×）Fig.2 Effect of ZAV on liver tissue morphology in mice （200×）

3 结论

镇江香醋是我国传统的四大名醋之一，其以优质糯米为主要原料，经传统的“固态分层”发酵工艺酿造制得，采用典型的天然多菌种混合发酵工艺。镇江香醋富含多种活性成分包括黄酮类、多酚类、维生素、皂苷类和活性多肽等。本研究结果显示，镇江香醋对高脂饮食诱导的小鼠NAFLD 有较好的保护作用，其作用机制与其能够降低小鼠的体质量和脂肪含量，增加机体的抗氧化能力，减轻小鼠的胰岛素抵抗和炎症反应有关。然而本研究指标有限，对镇江香醋干预NAFLD 的作用机制还需进一步深入研究，以获得更精确的结论，为NAFLD 研究提供新的思路。