正山小种红茶、茶多酚、茶多糖的抗氧化活性和对人体经络电压的作用初探

陈 琦 郭静科 许明明 俞晓卫 陈 汉 刘树滔 柯李晶 周建武* 饶平凡

（1 浙江工商大学杭州商学院 杭州311500 2 福州大学至诚学院食品与生物工程系 福州350002 3 泉州师范学院海洋与食品学院 福建泉州362000 4 中国科学院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心 杭州310035 5 福州大学生物工程研究所 福州350108）

正山小种，属红茶类，是世界上最早的红茶。正山小种仅产于世界自然遗产地——武夷山自然保护区桐木关一带，得天独厚的地理环境与气候条件赋予正山小种优越的品质，茶汤滋味浓厚、醇和，有独特的水果甜香以及松烟香，深得大众喜爱[1-2]。红茶具有防治心血管疾病[3]，抗肿瘤[4]，预防肥胖[5]和抗氧化[6]等生理功效。红茶富含儿茶素、茶黄素、茶红素等多种抗氧化多酚类成分、咖啡碱、氨基酸和茶多糖等活性物质，抗氧化成分中以抗氧化多酚和茶多糖最受关注[7]。

王好古[8]在《汤液本草》中最早明确提出茶叶的归经理论。食物的归经是指食物表现出对人体某脏腑及其经络有明显选择性的作用，是根据食物被食用后反映出来的效果，结合人体脏腑、经络的生理特点概括得来[9]。食物归经的判断更多依赖于人体主观感受，某种程度上与食品感官评价具有类似性，然而，目前尚未建立有客观评估的方法和手段。Xu 等[10]研究发现经络系统可能是一个承接、传递并处理超氧自由基的生物电网络系统，特定区域的体表电生理信号与体内的氧化应激水平存在密切相关性。本课题组在前期茶经络电压研究中发现茶汤（红茶、乌龙茶、绿茶）对小肠经的体表电位的影响存在显著差异，猜测该现象可能与不同茶品种对肠道的调节作用不同有关，同时也证实了茶汤作为天然的抗氧化剂，可调节体内氧化应激水平，且其氧化应激水平的改变能同步体现在体表电位的变化上[11]。

氧化应激（Oxidative stress，OS）是指机体内活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）代谢失衡，临床上发现大多数疾病均伴随着活性氧自由基的异常升高。氧化应激水平的改善能力是抗氧化候选药物的主要筛选指标，目前多通过长期观察比较体内脂质过氧化物、抗氧化酶系和炎症因子水平的高低来判断。食物带来的氧化应激反应和疾病模型有显著差异，比如饮食不当带来的口干、上火等症状，表现为局部且快速的氧化应激[12]。然而，现有观察氧化应激水平的模型并不能满足食物抗氧化研究和食品配方开发的需求。目前对于茶生理功效的研究大多都集中于长期饮用茶汤所带来的生理生化指标的变化或对肠道微生物菌群的调节，少有人关注饮用茶汤后人体即刻能感受到的心情愉悦，消食解腻等快速的生理感受及其可能的作用机制。

本研究通过体外抗氧化模型（氧化还原电位法、ORAC 法） 结合人体体表电生理信号测定，对受试志愿者在饮用红茶茶汤后，调查短时间内人体体表电位的变化规律，以期从体表电生理信号的变化规律上推测饮用红茶后人体短时间内氧化应激的变化规律。氧化还原电位 （Oxidation-reduction potential） 测定能反映体系中所有物质表现出来的宏观氧化还原性，可以表征介质氧化性或还原性的相对强弱，适合于表征茶汤这类组分复杂体系的抗氧化性[13]。氧化自由基吸收能力（Oxygen radical absorbance capacity，ORAC）是一种评价天然产物总抗氧化活性的重要方法和指标。ORAC 法是依据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化的原理进行测定，具有很高的特异性，其结果具有良好的重现性[14]。本试验还以同浓度的茶多酚和茶多糖溶液设置对比研究，比较具体成分和复合成分在抗氧化作用上的差异。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与主要仪器

正山小种红茶（产地武夷山自然保护区），武夷山正山茶业有限公司。

福林酚、浓硫酸、蒽酮、没食子酸、AAPH、荧光素钠（分析纯级），国药集团化学试剂公司。茶多酚（食品级），河南中泰食化有限公司；茶多糖（食品级），广州恒源食化有限公司。

紫外分光光度计（UV-1700），日本津岛公司；氧化还原电位仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；钙流工作站（FlexStation 3），美国Molecular Devices 公司；Ag/AgCl 一次性使用心电电极，上海钧康医用设备有限公司；多通道生理信号采集处理系统（RM6240C），成都仪器厂。

1.2 样品制备

取正山小种茶叶5 g，茶水比1∶20，用沸水冲泡3 次，每次冲泡45 s，过滤，将3 次所得的茶汤混合，待用。茶多酚标准液：配制与正山小种茶汤同浓度的茶多酚水溶液；茶多糖标准液：配制与正山小种同浓度的茶多糖水溶液。

1.3 福林酚法测茶多酚

用移液管分别移取没食子酸溶液、水（作空白对照） 及茶汤各1.0 mL 于试管内，分别加入5.0 mL 福林酚溶液，摇匀，反应5 min。再分别加入4.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，置于25 ℃下反应60 min。反应结束后，于波长765 nm 处测定各反应液OD 值。根据不同浓度的没食子酸标准溶液及其测定结果绘制标准曲线，依据标准曲线和茶汤稀释倍数，计算出茶汤样品中茶多酚的百分含量[15]。

1.4 硫酸-蒽酮法测定茶多糖

取茶汤样品溶液1.0 mL，加入0.05%的蒽酮-硫酸溶液4.0 mL 于试管内，100 ℃反应5 min，于波长675 nm 处测定OD 值。根据不同浓度半乳糖标准溶液及其测定结果绘制标准曲线，依据标准曲线和茶汤稀释倍数，计算出茶汤样品中茶多糖的百分含量[16]。

1.5 氧化还原电位测定

分别取200 mL 正山小种茶汤、蒸馏水、茶多酚标准液、茶多糖标准液做氧化还原电位的测定。铂电极在使用前，经过醌氢醌标准饱和溶液标定。各样品均置于45 ℃水浴中保温，用ORP 电极测定，重复3 次，取平均值。

1.6 ORAC 法测定茶汤抗氧化能力

ORAC 反应均在75 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）体系中进行，受试样品、荧光素钠盐（Fluorescein sodium，FL）、AAPH、Trolox 均用同浓度磷酸盐缓冲液溶解，并稀释至适当浓度。在96 孔黑色荧光酶标板各微孔中分别加入不同待测液25 μL，向各微孔中加入浓度为8.61×10-5mmol/L 的FL 溶液150 μL，中速振荡2 min，在37 ℃下孵育10 min 后，加入浓度为153 mmol/L 的AAPH 溶液25 μL。以激发波长（485±20）nm，发射波长（530±20）nm 连续测定最终反应体系的荧光强度，整个体系保持37 ℃，每2 min 测定1 次荧光强度，测定时间设定在荧光衰减呈基线后为止。最后结果转换成Trolox 当量，用μmol TE/g 表示各受测样品的抗氧化能力[17]。

1.7 临床试验

1.7.1 试验对象 试验收集30 名志愿者。纳入标准：（1）年龄>18 岁；（2）签署知情同意书，自愿参加试验者；（3）遵从研究方案，试验期间能够配合试验者。排除标准：（1）年龄≤18 岁；（2）有肾、肝、心血管疾病或者其它严重器质性疾病；（3） 有酗酒、抽烟、滥用毒品等不良嗜好；（4）有长期的药物治疗；（5）不积极配合试验或资料不全影响观察结果者。

1.7.2 试验方案及流程 按照古籍[8]对茶的归经记载以及本课题组前期预试验，筛选出与茶相关的活跃经络。选取各条经络上的合穴和原穴（表1）作为经络电压的测量点，均以合穴为正极，原穴为负极。受试者饮用红茶的同时进行经络电压监测，对照组饮用等量水、茶多酚标准液与茶多糖标准液。

表1 经络电压的测量点Table 1 The selected acupuncture points

试验前1 d 提供标准餐，保证受试者饮食清淡，避免饮用咖啡、茶、酒。测量前受试者需静躺，保持心情平静。向其询问24 h 内的身体状态并记录。穴位的选择和确定参照GB/T12346-2006[18]，将测量穴位点附近毛发修剪，用医用酒精擦拭，待其挥发后，按标准寻找出穴位。使用Ag/AgCl 一次性心电电极贴粘穴位处，连接电极和生理信号采集处理系统，开始采集数据。

试验于早晨9：30 开始（早餐后2 h）。经络电压显示稳定后，提供200 mL 茶汤于受试者饮用，5 min 内饮用完毕，期间持续经络电压监测，监测时间为90 min。每个受试者需做4 次试验，分别采集饮用正山小种、茶多酚标准液、茶多糖标准液、水后的人体经络电压数据。避免组间干扰，每次试验间隔2 d。

1.8 数据处理方法

采用SPSS for windows 13.0 统计软件做数据分析，测定样本结果以平均数±标准差（x¯±s）表示。

2 结果与分析

2.1 氧化还原电位和ORAC 抗氧化活性测定

通过福林酚法、硫酸-蒽酮法测得正山小种茶汤中的茶多酚与茶多糖的含量分别为（162.88±0.52）μg/mL 和（498.88±30）μg/mL。为调查茶汤中含有的主要功效成分对人体经络电压的影响是否与茶汤一致，在随后的试验中分别配制了不同浓度的茶多酚和茶多糖溶液作为对照样品做比较测定。此外，对水、正山小种茶汤、茶多酚溶液和茶多糖溶液的氧化还原电位测定结果如图1所示，分别为 （268.50 ±1.27），（323.35 ±4.74），（310.80±4.53），（259.85±3.04）mV，数据表明在该测试中正山小种茶汤和茶多酚溶液均未能降低水的氧化还原电位，只有茶多糖溶液表现出较弱的还原性。而ORAC 抗氧化活性测定结果表明，正山小种茶汤、茶多酚溶液和茶多糖溶液的抗氧化能力值分别为 （318.84±3.06），（104.01±9.12），（66.19±9.51）μmol TE/g（图2），抗氧化活性上正山小种茶汤>等浓度的茶多酚溶液>等浓度的茶多糖溶液。氧化还原电位的测定结果通常能显示所测试样品的直接还原性，其数值越低则还原性越强。ORAC 抗氧化活性测定和氧化还原电位测定结果的差异说明受试样品的抗氧化性并不依赖于样品自身表现的直接还原力。

2.2 对胃经电压的影响

在饮用90 min 后，水组、茶汤组、茶多酚组、茶多糖组的胃经电压极差值分别为（24.0±15.8），（14.2±11.5），（19.8±13.8），（27.3±22.9）mV，其中，只有茶多糖组的胃经电压波动极差值明显大于水组，茶汤组与茶多酚组均显著低于水组，以茶多酚组最低（图3）。结果显示饮用茶多糖溶液90 min内对胃经电压影响显著，提示同时段内胃经上超氧自由基水平波动较大。从不同时间段分析，饮用5 min 后，水组、茶汤组、茶多酚组、茶多糖组胃经电压变化的差值分别为 （1.0±9.2），（7.0±10.2），（5.9±12.2），（8.8±12.3）mV（图4）。相较水组，茶汤组、茶多酚组、茶多糖组胃经电压差值均有增加，仍以茶多糖的变化幅度最大。该结果显示茶汤等受试样品对体表电生理信号的干预不仅有区域性上的差别，还有作用时间上的差异。茶汤组、茶多酚组、茶多糖组均表现出在短时间内（5 min）对胃经电压的调节作用，然而随着测试时间的延长，茶汤组和茶多酚组对胃经电压的调节作用减弱，只有茶多糖溶液表现出对胃经电压的持续调节作用（90 min 内）。

图1 不同试验溶液ORP 值Fig.1 The ORP value of different solution

图2 ORAC 法测定不同试验溶液荧光曲线衰减图Fig.2 The effect of different solution on the fluorescence decay curve with ORAC assay

图3 不同试验溶液对胃经电压的影响Fig.3 The effect of different solution on stomach meridian

图4 不同试验溶液5 min 胃经电压的变化Fig.4 The variation of different solution on stomach meridian in five minutes

2.3 对心经电压的影响

在饮用90 min 后，水组、茶汤组，茶多酚组、茶多糖组心经电压极差值分别为 （28.9±13.1），（27.3±11.2），（31.2±19.6），（19.3±14.1）mV。其中，只有茶多酚组心经电压极差值明显大于水组，茶汤组与茶多酚组均显著低于水组，以茶多糖组为最低（图5）。结果显示饮用茶多酚溶液90 min 内，对心经电压影响显著，提示该时段内心经上超氧自由基水平波动较大，同期受试者有醒头目、心情愉悦的主观感受。同时心经上的超氧自由基代谢活跃，心经电压表现高幅度的波动。在饮用5 min后，水组、茶汤组、茶多酚组、茶多糖组心经电压变化的差值分别为 （2.8±14.8），（15.4±16.1），（14.5±15.6），（7.8±7.7）mV（图6）。相较水组，茶汤组、茶多酚组、茶多糖组在饮用5 min 后对心经电压差值均有增加，茶汤和茶多酚造成的变化幅度更为显著。该结果表明茶汤组、茶多酚组、茶多糖组均表现出在短时间内（5 min）对心经电压的调节作用，然而随着测试时间的延长，茶汤组和茶多糖组对心经电压的调节作用减弱，只有茶多酚溶液表现出了对心经电压的持续调节作用（90 min 内）。

2.4 对肺经电压的影响

在饮用90 min 后，水组、茶汤组、茶多酚组、茶多糖组肺经电压极差值分别为 （20.9±11.9），（22.7±10.6），（22.3±12.9），（21.4±19.8）mV。以水组肺经电压为对照，受试者饮用正山小种茶汤、茶多酚溶液、茶多糖溶液90 min 后，肺经电压波动极差均有增加，增加幅度从强到弱依次为正山小种茶汤>茶多酚溶液>茶多糖溶液（图7）。肺经电压出现明显变化，表明肺经上的超氧自由基水平的实时变化，这或许能为中医所描述的茶汤具有清肺的作用提供支持。5 min 的肺经电压变化显示，水组、茶汤组、茶多酚组、茶多糖组差值分别为（3.8±10.9），（12.9±10.3），（11.5±8.3），（2.5±7.3）mV（图8），短时间内（5 min）茶汤与茶多酚溶液均表现出对肺经电压的快速调节作用。与同期水组相比，其作用程度明显强于长期（90 min），表明茶汤对肺经的调节作用很可能发生在前期阶段。有研究表明茶汤中的酚类物质是抗氧化的主要功效成分[19-20]，然而从肺经电压的结果来看，茶汤对肺经的抗氧化作用不能简单归咎于茶多酚的单一作用。

图5 不同试验溶液对心经电压的影响Fig.5 The effect of different solution on heart meridian

图6 饮用不同试验溶液5 min 心经电压的变化Fig.6 The variation of different solution on heart meridian in five minutes

图7 不同试验溶液对肺经电压的影响Fig.7 The effect of different solution on lung meridian

图8 饮用不同试验溶液5 min 肺经电压的变化Fig.8 The variation of different solution on lung meridian in five minutes

2.5 对脾经电压的影响

在饮用90 min 后，水组、茶汤组、茶多酚组和茶多糖组脾经电压极差值分别为 （39.7±22.2），（33.9±25.3），（39.4±22.6），（34.0±7.2）mV （图9）。试验组的脾经电压波动均弱于对照组（水组），受试茶汤及成分溶液对脾经电压均无明显影响。5 min 内，水组、茶汤组、茶多酚组和茶多糖组脾经电压极差值分别为（19.5±8.0），（19.8±19.4），（8.2±13.2），（1.3±9.5）mV（图10），未表现出对脾经电压的明显调节作用。数据显示茶汤收敛脾胃的作用仅对胃经电压有显著影响，在脾经上却没有相同的表现。本试验跟踪监测了饮用受试溶液90 min内的经络电压，可能并未到脾经起效时间，进一步试验时，有必要延长试验跟踪时间。

2.6 饮用茶汤及其功效成分对体表电生理信号的影响

分析上述受试者饮用正山小种茶汤、茶多酚和茶多糖标准溶液后相关体表电生理信号的变化结果表明：1）饮用茶汤、茶多酚和茶多糖标准溶液90 min 后，影响经络电压区域有显著差异。正山小种茶汤仅表现出对肺经电压有明显调节作用，茶多酚标准溶液表现出对心经和肺经有明显调节作用，茶多糖标准溶液则表现出对胃经和肺经有明显调节作用；2） 饮用茶汤及其功效成分对经络电压的影响具有时效性：饮后5 min，茶汤、茶多酚和茶多糖标准溶液均表现出对心经、胃经以及肺经明显的调节作用，然而，随饮用时间的延长，正山小种茶汤对心、胃、肺经调节能力均显著减弱。饮茶及其功效成分对经络电压影响的时效性，可能与所饮用抗氧化物质在消化道不同部位的吸收和抗氧化有关。中医认为“心开窍于舌，舌为心之外候”，可以理解为抗氧化成分在口腔、舌头上的抗氧化作用能影响到心经经络电压，还有“咽为胃系之所属，与胃相通，是水谷之通道”的说法，或与所饮用的抗氧化物质在食道上端（如咽喉）进行抗氧化后能影响到胃经有关。

图9 不同试验溶液对脾经电压的影响Fig.9 The effect of different solution on spleen meridian

图10 饮用不同试验溶液5 min 脾经电压的变化Fig.10 The variation of different solution on spleen meridian in five minutes

3 结论

上述结果显示，当受试者饮用茶汤及茶多酚、茶多糖溶液后，经络电压会出现明显变化，并且不同成分作用的经络不同。茶汤由口过咽喉入胃至肠，心、肺、胃的经络电压都在饮用受试溶液后发生快速而显著的变化。有研究发现传统食物“汤”中所富含的抗氧化微纳米胶粒可直接作用于消化道黏膜层[21]，而应用抗氧化剂干预穴位，可引起经络穴位电压的变化[10]。由此推断茶中某些物质与口腔、胃、肠黏膜发生反应，清除口、喉、咽部黏膜层的氧自由基，调节体内氧化应激水平，从而调节对应的心、肺、胃经络体表穴位的电压。另外，本试验茶汤中单一的茶多糖、茶多酚溶液与受试茶汤本身引起的经络电压不完全一致，猜测食物纳米胶粒构造能显著影响其对人体的生理作用，这将是本试验进一步探究的内容。茶的作用已广为人知，大量研究证明通过长期饮茶有降血脂、降血糖、抗氧化等保健作用[22]。本文通过试验发现茶的人体经络穴位电压与茶汤的生理作用存在相应联系，为通过检测经络穴位电压判定食物对人体的反应（在自身感觉之外）提供有效依据。