基于GB 4789.10-2016的银白色葡萄球菌鉴定方法的改进

2020-11-12金方宁张道锋区楚君史贤明施春雷

中国食品学报 2020年10期

金方宁张道锋区楚君史贤明施春雷

（上海交通大学农业与生物学院中美食品安全联合研究中心上海200240）

银白色葡萄球菌（Staphylococcus argenteus，简称银葡菌）是金黄色葡萄球菌（S.aureus，简称金葡菌）的远源分化谱系之一，于2015年正式鉴定为新物种[1]。由于银葡菌基因组中缺少操纵子crtOPQMN，导致无法合成葡萄球菌黄素（Staphyloxanthin），其细菌菌落为乳白色[2]，易与菌落表型为白色的金葡菌相混淆，因此无法通过菌落颜色将二者区分。银葡菌和金葡菌虽然在表型和基因型上有诸多相似之处，但是与金葡菌在核心基因组上存在约10%的差异[2]。常规的生化分析很可能将银葡菌错误地鉴定为金葡菌，16S rRNA 测序分子鉴定方法也无法区分银葡菌和金葡菌[1]。多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）虽可明确区分金葡菌和银葡菌，但金葡菌的7 个MLST基因位点中，aroE 和glpf 很难扩增，需重新设计引物才能完成MLST 分型，这可能导致很多银葡菌分离株在早期研究中未被报道或被忽略[3-4]。

迄今为止，已有20 多个国家和地区相继报道从医院或社区获得银葡菌，证实了银葡菌为全球分布，且多与严重的发病率、死亡率以及医院感染有关[5]。产毒性银葡菌的无症状携带者往往是疾病的潜在来源，也是食品污染的主要风险，可能导致食物中毒。缅甸报道了5 株定植于健康食品加工者的银葡菌分离株[6]。在最近的一次中国零售即食食品金葡菌流行性调查中获得的8 株金葡菌分离株（分离自三亚、广州、成都、湛江、厦门），根据其MLST 分型结果[7]来看，很可能是银葡菌。本课题组报道了6 株在上海和宁波分离得到的银葡菌，其中1 株分离自食物中毒患者肛拭子，1 株分离自五花肉[8]。这些研究表明银葡菌很可能会污染食品，并导致食物中毒。日本报道了3 起与银葡菌相关的食物中毒事件（2010年、2014年和2015年）[9-10]。研究结果表明，这些银葡菌分离株获得携带肠毒素（Staphylococcal enterotoxins）基因的可移动遗传元件（Mobile genetic elements），通过基因水平转移，使得银葡菌高度产毒，提高了食物中毒风险，成为食品安全的新威胁[10]。

由于银葡菌无法合成葡萄球菌黄素，在体外对氧化应激和嗜中性粒细胞杀伤更为敏感[11-12]，因此人们认为银葡菌是一种低毒力细菌[2]。然而，基因组学分析表明，银葡菌与金葡菌之间的毒力基因含量没有差异[13-14]，而且最近几项研究表明，银葡菌具有与金葡菌相类似的致病能力，也可引起严重的临床感染症状，甚至导致死亡[15-17]。在已报道的菌株中部分分离株表现出较高的耐药性[18-19]。综上，银葡菌是一种新型病原体，需高度重视。

本课题组前期研究发现，金葡菌在一个假定的非核糖体肽合成酶（Nonribosomal peptide synthetase，NRPS）基因序列中存在60 个氨基酸的缺失，而银葡菌不发生该缺失，基于此可有效鉴定银葡菌[8]。由于银葡菌和金葡菌在表型和基因型上高度相似，易于发生混淆，而我国目前尚未建立银葡菌检验的标准方法，因此本研究使用我国金葡菌检验标准（GB 4789.10-2016 第一法）流程对本室保有的金葡菌和银葡菌分离株进行验证和比较，以探讨该法对检验银葡菌的适用性和局限性，进而对我国金葡菌和银葡菌的检验方法提供补充建议。

1 材料

1.1 菌株

金葡菌标准菌株ATCC 8095、金葡菌分离株193 株（113 株为上海市疾病预防控制中心于2011-2014年按GB 4789.10-2016 第一法分离自食品、健康人或门诊病人；80 株为本室于2014-2015年按GB 4789.10-2016 第一法分离自上海市售速冻米面制品）、银葡菌标准菌株DSM 28299、银葡菌分离株6 株（SJTU F20124，F20419，F20420，F21164，F21224 和F21285[8]）、不具有血浆凝固酶活性的溶血性葡萄球菌SJTU F21469（于2015年分离自上海市售速冻米面制品）均由上海交通大学食品安全与微生物实验室保藏。

1.2 主要试剂和仪器

Baird-Parker 培养基、豆粉琼脂、亚碲酸钾卵黄增菌液，北京陆桥；脱纤维绵羊血、新鲜兔血浆，广州未来；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、脑心浸出液肉汤（BHI），英国Oxoid；TIANamp 细菌基因组DNA 提取试剂盒，北京天根；溶菌酶，美国Sigma；Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye），大连宝生物。

ES-315 型高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY；DHP-9162 型恒温培养箱，上海一恒；CX31 RTSF型光学显微镜，日本Olympus；HMI-60 型细胞多点接种仪，天津恒奥；PCR 扩增仪、微量台式离心机5424D，德国Eppendorf；Nano Drop 2000 超微量分光光度计，美国Nano Drop；DYY-6C 型电泳仪，北京六一；Tanon-3500 型凝胶图像处理系统，上海天能。

2 试验方法

2.1 菌株的活化

从-80 ℃超低温冰箱中取出菌株的甘油保藏管，无菌条件下用接种环蘸取菌液划线接种至胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基（TSA）。于37 ℃恒温培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种于新的培养基上培养12 h 后用于后续试验。

2.2 初步鉴定

挑取细菌单菌落接种到5 mL TSB 液体培养基中，37 ℃摇床200 r/min 过夜培养。根据GB 4789.10-2016 方法，用无菌接种环蘸取菌液划线接种到Baird-Parker 平板，37 ℃培养36 h。溶血性检测方法将划线法改进为点接法，将过夜培养的菌液用TSB 液体培养基1∶100 稀释至约106CFU/mL，吸取200 μL 至96 孔板，用细菌多点接种仪接种至血平板上，37 ℃培养24 h 后用电子游标卡尺测量溶血圈直径，以金葡菌标准菌株ATCC 8095 作为阳性对照，做3 次生物学重复并取平均值。

2.3 确证鉴定

2.3.1 染色镜检用接种环挑取待检菌株菌悬液2～3 环涂于洁净载玻片上，待干燥后，热固定涂片。滴加草酸铵结晶紫染液初染约1 min，用水冲洗；加卢戈氏碘液覆盖涂面媒染约1 min，用水冲洗。加95%乙醇数滴，并轻轻摇动脱色，后用水冲洗；用番红染液复染约2 min，用水冲洗。干燥后，用油镜观察。

2.3.2 血浆凝固酶试验挑取细菌单菌落接种到5 mL BHI 液体培养基中，37 ℃培养24 h。取新鲜配制兔血浆0.5 mL，放入1.5 mL 无菌离心管中，加入BHI 培养物0.25 mL，振荡摇匀，置于37 ℃水浴箱内，每0.5 h 观察1 次是否出现凝固现象，持续6 h。同时以金葡菌标准菌株ATCC 8095 和无血浆凝固酶活性的溶血性葡萄球菌SJTU F21469的肉汤培养物分别作为阳性和阴性对照。

2.4 DNA 提取

取2 mL 过夜培养的菌液10 000 r/min 离心2 min，弃上清。向菌体沉淀中加入180 μL 终质量浓度为20 mg/mL 的溶菌酶，37 ℃处理45 min。之后按基因组提取试剂盒说明提取DNA。

2.5 目的基因鉴定

以金葡菌标准菌株ATCC 8095 和银葡菌标准菌株DSM 28299 为阳性对照，无菌水为阴性对照，分别对193 株金葡菌分离株和6 株银葡菌分离株进行nuc1 和NRPS 基因的PCR 鉴定，引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列如表1所示。

表1 金黄色葡萄球菌和银白色葡萄球菌的鉴定引物Table 1 Primers used to identify S.aureus and S.argenteus isolates

PCR 反应体系25 μL，包括Premix TaqTM12.5 μL，引物上、下游（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 循环参数：nuc1 反应为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 个循环；NRPS 反应为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 个循环。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压为125 V，电泳结束后使用紫外凝胶成像系统成像并观察结果。

2.6 统计分析

本研究使用GraphPad Prism 7 软件进行试验数据的统计分析。采用t-test 方法，对金葡菌和银葡菌溶血圈直径的差异进行显著性分析。

3 结果与分析

3.1 生化鉴定结果

所有受试菌株（193 株金葡菌分离株和6 株银葡菌分离株）在Baird-Parker 平板上均呈典型菌落状态，即所形成菌落圆形凸起，表面光滑且有光泽，颜色呈灰黑色或黑色，边缘为淡色，周围绕以浑浊带，在其外层有一清晰的透明圈，接种针接触菌落有似奶油至树胶样的粘稠感，银葡菌与金葡菌菌落大小和形态无明显差异。

在血平板上，3.6%（7/193）的金葡菌分离株无明显溶血现象，96.4%（186/193）的金葡菌分离株呈典型菌落状态，即所形成菌落较大，光滑凸起、湿润，菌落颜色呈金黄色或白色，菌落周围绕以溶血圈，特别的是，溶血圈状态有3 种类型：边缘模糊的完全透明圈，边缘清晰的暗红色圈，内圈暗红色外圈完全透明（图1）。也有研究报道表明一些金葡菌株虽携带溶血基因，但未表现溶血[21]，这可能是因为溶血基因中整合了携带免疫逃逸簇（Immune evasion cluster，IEC）的原噬菌体，导致溶血基因被破坏，无法正常表达[22]。6 株（100%）银葡菌分离株菌落均呈典型的完全透明溶血圈（β 溶血），菌落颜色呈白色。本研究显示银葡菌平均溶血圈直径显著高于金葡菌的平均水平（图2），由于银葡菌菌株数相对较少，两者样本量不对等，因此对银葡菌溶血能力与金葡菌相比具有显著差异这一结论，需要进一步验证。

染色镜检结果显示金葡菌和银葡菌都为革兰氏阳性球菌，菌体排列呈葡萄串簇状，无芽孢，无鞭毛，无荚膜，直径约为0.5～1 μm。血浆凝固酶试验中，发现2.1%（4/193）的金葡菌分离株试验6 h后，血浆结果呈半流质絮状，未能达到阳性判断标准（血浆凝固或凝固体积大于原体积的一半），阳性率为97.9%（189/193）。6 株银葡菌分离株中，有1 株结果也呈半流质絮状，未能到达阳性判断标准，阳性率为83.3%（5/6）。之前有研究报道表明少数金葡菌需要超过6 h 乃至24 h 才能形成凝块，这与试验条件和菌株特性有关[23]；此外，极少数金葡菌菌株在凝固酶试验为阴性，可能由于荚膜多糖掩蔽了凝聚因子[24]或菌株为天然的凝固酶基因缺失突变株[25]。

图1 金葡菌和银葡菌分离株在血平板上的菌落形态（多点接种法）Fig.1 The colony morphology of S.aureus and S.argenteus isolates on blood plate using multipoint method

从生化鉴定结果可知，本室保存的6 株银葡菌分离株在生化表型上与金葡菌无明显差异，因此在GB 4789.10-2016 的检验标准下，银葡菌也会被检出，被判断为金葡菌。银葡菌已经被证明可以污染食品，并导致食物中毒[8-10]，因此GB 4789.10-2016 也可以对食品中的银葡菌起到监测作用。

金葡菌是导致食源性疾病高发的重要病原菌之一，其产生的肠毒素可引起食物中毒[26]。基于检验效率和成本的考虑，大多数有关食品中金葡菌污染调查都采用GB 4789.10-2016 的检验流程。本研究结果表明，并非所有金葡菌和银葡菌都具备溶血能力或能表达血浆凝固酶活性，因此，这部分分离株在检验鉴定过程中容易被排除。

图2 金葡菌和银葡菌分离株溶血圈直径的差异Fig.2 The diameter comparison of hemolysis zone of S.aureus and S.argenteus isolates

3.2 目的基因鉴定结果

193 株金葡菌分离株nuc1 阳性率为100%，短片段NRPS 阳性率为100%；6 株银葡菌长片段NRPS 阳性率100%，nuc1 阳性率为100%（图3、图4）。而银葡菌nuc1 扩增产物的电泳条带明显淡于金葡菌，且有明显的引物二聚体，可能所扩增的nuc1 序列与金葡菌存在差异（图3）。

图3 金葡菌和银葡菌nuc1-PCR 扩增产物电泳图谱（部分菌株）Fig.3 nuc1-PCR amplification from partial S.aureus and S.argenteus isolates

图4 金葡菌和银葡菌NRPS-PCR 扩增产物电泳图谱（部分菌株）Fig.4 NRPS-PCR amplification from partial S.aureus and S.argenteus isolates

nuc1 基因编码的是金葡菌特有的耐热核酸酶，该基因高度保守，是广泛用于检测金葡菌的靶点基因[27]。从扩增结果来看，银葡菌同样能扩增出相同大小的基因片段，因此以nuc1 作为检测靶点会将银葡菌误检为金葡菌。这与一些已报道的研究结果相同，虽扩增产物电泳结果为阳性，但序列分析结果显示银葡菌nuc1 序列与金葡菌相比存在缺失和插入现象[1，10，28]，也有一些研究报道所获得的银葡菌分离株无法扩增出nuc1[29]，可能与所用的引物不同有关，因此，以nuc1 为靶点检验银葡菌所得的结果并不可靠，很可能造成误检或漏检。而以NRPS 作为靶点则可以很好的区分银葡菌和金葡菌，即金葡菌由于NRPS 存在基因序列上的缺失，扩增出比银葡菌更短的产物，可以根据PCR 产物片段大小将二者加以区分[8]。

3.3 检测流程改进

上述结果表明，金葡菌和银葡菌的生理生化特征基本一致，说明GB 4789.10-2016 第一法可以检出金葡菌和银葡菌，并真实反映其在食品中的污染程度，然而该法无法区分两者；常用的检测靶点基因nuc1 同样无法区分金葡菌和银葡菌，而本室建立的靶点基因NRPS 可以准确鉴定区分金葡菌和银葡菌。另外，极少数金葡菌株不具备溶血能力或血浆凝固酶活性，第一法虽可满足基本定性检验，但也存在漏检的可能。该法需要进一步完善。

因此，为提高金葡菌定性检验的准确性以及准确区分金葡菌和银葡菌，本文基于GB 4789.10-2016 检验标准第一法，提出改进流程（图5）。此方法检验周期约3 d，耗时相对较短，适合一般微生物实验室大批量分离鉴定金葡菌和银葡菌菌株，缺点为Baird-Parker 选择性分离这一步可能会存在较多的假阳性菌株，因此需要用标准菌株进行阳性对照，提高选择典型菌落的准确率；其次，DNA 提取较繁琐，可用试剂盒法进行提取，提高效率。