靶向细菌细胞壁新型食品保鲜剂的虚拟筛选

高 双 杨银萍 宋佳旭 宫兴文

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

微生物生长繁殖是导致食品腐败变质的重要原因，食品在原料处理、生产、包装及运输和销售等过程中均有可能被微生物污染[1]。导致冷鲜肉腐败变质的微生物以细菌为主，包括需氧嗜冷的莫拉氏菌属（Moraxella）、假单胞菌属（Pseudomonas）和兼性厌氧的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）等革兰氏阴性菌，以及乳杆菌属（Lactobacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）等革兰氏阳性菌[2]。目前市场上的保鲜剂种类繁多，有合成的、天然的，大多数保鲜剂的作用机理并不明确。溶菌酶、壳聚糖、茶多酚以及Nisin 等是目前研究较多的几种保鲜剂，而这些保鲜剂局限性明显，其中大部分保鲜剂是针对革兰氏阳性菌，而对大肠杆菌（Escherichia coli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）等革兰氏阴性菌的抑菌效果较差或根本没有效果，并且部分保鲜剂（如有机酸等）作用于细胞膜，可能给同样具有细胞膜结构的人体带来伤害[1]。

细胞壁是微生物和植物细胞的特有结构，对维持细胞的形态结构和体内外渗透压平衡起重要作用，而人和其它动物的细胞均没有细胞壁，若以细菌细胞壁为保鲜剂的作用靶点，原则上对人体细胞无害或者毒害较小[2]。细菌细胞壁的主要结构成分为肽聚糖（又称粘肽、胞壁质），在肽聚糖的生物合成过程中，粘肽合成酶 （Penicillin-binding proteins，PBPs）起着至关重要的作用，该酶具有很高的转肽酶和羧肽酶活性，对细菌的生长与繁殖均有重要作用[3-5]。若能找到合适的先导化合物，使其与细菌的粘肽合成酶结合，抑制该酶的活性，则可使细菌细胞壁缺损，菌体膨胀裂解而死亡，β-内酰胺类抗生素（如青霉素类和头孢菌素类）就是通过此机理来发挥杀菌作用[6-7]。

本研究采用分子对接软件DOCK6.5 进行虚拟筛选，针对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和大肠杆菌的多个粘肽合成酶进行多靶点的大规模筛选，以期筛选出对革兰氏阴性菌具有较好抗菌活性的先导化合物。此外，以冷鲜肉为原料，以山梨酸钾为阳性对照，测定先导化合物的保鲜效果。

1 材料和方法

1.1 软件及数据库

DOCK6.5 程序为免费软件，由美国加州大学Kuntz 等开发。

本研究所用的小分子化合物结构来自于ZINC 数据库的drug-like 子集，数量约580 万个。

1.2 材料及试剂

山梨酸钾、氯化钠、氧化镁，天津永大化学试剂有限公司；硼酸，阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸、乙醇，国药集团化学试剂有限公司；营养琼脂固体培养基，杭州微生物试剂有限公司。

1.3 仪器及设备

KDN-103F 凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；pH 计（DELTA320），特勒托利多仪器有限公司；CR-400/410 色差计，柯尼卡美能达；BIO-05拍打器，上海般诺生物科技有限公司；玻璃培养皿（直径90 mm），杭州汇普化工试剂有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；LDEX-5OKB 立式蒸汽压力灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SHP-250 智能生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；101-5 电热恒温鼓风干燥箱，武汉药科新技术开发有限公司；JJ-CJ-IFD 超净工作台，苏州市金净净化设备科技有限公司；Haler BCD-278B 冰箱，青岛海尔电冰箱有限公司。

1.4 虚拟筛选

采用DOCK6.5 进行分子对接，以铜绿假单胞菌的粘肽合成酶PBP3 和大肠杆菌的粘肽合成酶PBP1b，PBP4 和PBP5 作为虚拟筛选的靶点。首先，以PBP3 为起始，将ZINC 数据库中的小分子化合物依次对接入受体蛋白的活性中心，通过基于Grid score 的能量计算，筛选出能量低于-125.58 kJ/mol 的化合物结构，用于下一个靶点的对接。依次对各个靶点进行对接，筛选出对各个靶点均具有较好Grid score 打分的化合物结构，按照上述顺序进行第2 轮基于Amber score 的筛选，筛选出对各个靶点均具有较好Amber score 打分的化合物结构。之后，根据化合物的结构及在各个靶点的打分情况，挑选出亲和力高且结构新颖的先导化合物。

1.5 先导化合物的合成[1，9]

在100 mL 二氯甲烷中加入三聚氯氰5.0 g 搅拌溶解，另取50 mL 二氯甲烷，加入5.2 mL N-N二异丙基乙胺和2.68 mL 哌啶，将上述溶有三聚氯氰的二氯甲烷逐滴加入，并维持反应温度在0℃，反应2 h 后分别用2×100 mL 浓盐酸和100 mL水进行水洗，静置分层，取二氯甲烷层，旋蒸除去二氯甲烷，烘干，得到淡黄色固体粉末。

我们发现：不是学生天生不爱读书，而是他们无书可读，无感兴趣的书。根据这一情况，我们在班级层面，组建“班级读书互助会”，解决书籍的来源问题。苏霍姆林斯基在他的《课堂教学与课外阅读》一文中曾提到“书籍合作社”一词。我们发现“书籍合作社”与我们创设的“班级读书互助会”有异曲同工之处。它们都是为了解决学生无书可读的问题，都是为了解决书籍的来源问题。

取上述步骤中合成的产物4.66 g 溶解于丙酮，另取6.6 g 氢氧化钠和3.45 g 甘氨酸溶解于50 mL 水中，于1 h 内逐滴加入到上述丙酮溶液中，70 ℃反应4 h 后冷却，在室温继续搅拌1 h，然后用浓盐酸调节pH 值至2，冰浴20 min，使固体析出后，过滤，用10 mL 蒸馏水洗3 次，再用10 mL丙酮洗2 次，70 ℃烘干，得到白色固体粉末[1，9]。

1.6 先导化合物的保鲜效果

1.6.1 样品预处理[1]取冷鲜肉，无菌操作，切成50 g 左右的肉块，分为3 组。空白对照组以无菌水处理，阳性对照组用1 mg/mL 山梨酸钾处理，试验组以1 mg/mL 先导化合物处理。将肉块在不同处理液中浸泡2 min，然后沥干10 min，用灭过菌的保鲜膜紧密包裹，尽量除去空气，置于冰箱冷藏室保存。之后，每3 d 取样测定1 次[1]。

1.6.2 冷鲜肉pH 值的变化 参照GB/T 9695.5-2008《肉与肉制品pH 测定》的方法测定。评定标准为：pH 值不超过6.2 为新鲜肉，pH 值在6.3～6.6为次鲜肉，而pH 值超过6.7 为变质肉[1，10]。

1.6.3 冷鲜肉菌落总数的变化 参照GB 4789.2-94《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的方法测定。评定标准为：菌落总数小于1×104CFU/g为一级鲜肉，在1×104～1×106CFU/g 为二级鲜肉，而菌落总数超过1×106CFU/g 为变质肉[1，11]。

1.6.4 冷鲜肉汁液流失率的变化 将保藏的冷鲜肉样品放置于天平上，记录其质量为m1；取下保鲜膜，擦干肉及保鲜膜中所有液体后再次称重，记为m2；称量保鲜膜的质量，记为m3。根据文献中的公式计算冷鲜肉汁液流失率[1，12]，重复测定3 次，取平均值作为最后的结果。

1.6.5 冷鲜肉挥发性盐基氮（TVB-N）的变化 参照GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中的半微量定氮法，测定冷鲜肉的挥发性盐基氮含量[1，13]。

1.6.6 冷鲜肉色差的变化[1]使用色差计测定冷鲜肉的颜色变化，测定方法：将保藏的样品切成1 cm×1 cm×1 cm 的肉块，用色差计测定这些肉块的L*值、a*值和b*值，重复测定3 次，取平均值作为最终结果。其中，L*值表示肉的亮度，a*值反映肉的红度，二者与肉的新鲜度呈正相关，数值越大则越新鲜，b*值代表黄度，与肉的新鲜度呈负相关[1]。

2 结果与分析

2.1 配体与受体文件的制备

从protein data bank 网站下载铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3、大肠杆菌粘肽合成酶PBP1b，PBP4，PBP5 与配体的复合物晶体结构，按照DOCK6.5 手册进行配体和受体文件的制备，主要包括删除多余亚基，去除溶剂，加氢，加电荷，修正错误命名的氨基酸残基等处理，保存为相应的文件。

2.2 生成球集

利用DOCK6.5 自带的sphgen 程序产生球集，选择距离配体结合位点5 Å 范围内的球集，去除其中位置不佳的的球集，作为分子对接时的结合位点，再生成一个距离球集10 Å 的盒子，用于限制先导化合物的结构大小。

2.3 第1 轮筛选

利用Grid score 进行能量打分，挑选与各个靶点的相互作用能均低于-125.58 kJ/mol 的化合物结构，约6 万个，用于下一轮的虚拟筛选。

2.4 第2 轮筛选

采用Amber score 进行第2 轮能量打分，Amber score 的优势是距离配体特定距离的受体氨基酸残基是柔性的，配体结构也是柔性的，使得二者之间的相互作用更加符合诱导契合效应，因而计算结果更加精确，然而计算量大，因而速度较慢。

经第2 轮虚拟筛选，挑选出与各个靶点之间相互作用能均低于-87.72 kJ/mol 的化合物结构，约有200 个。经结构分析，发现筛选出的大部分化合物结构新颖，未发现有相关的研究报道。同时，绝大多数化合物的结构比较复杂，较难合成，还有一些化合物的合成原料成本过高。因此，拟选取其中一种结构较简单的先导化合物进行研究，该化合物的化学结构如图1所示。

图1 先导化合物的化学结构Fig.1 Chemical structure of lead compound

这个化合物的结构较简单，易于合成，而且其结构上含有两个甘氨酸基团，安全性方面也有一定的保证。该化合物与铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3、大肠杆菌粘肽合成酶PBP1b，PBP4 和PBP5的Grid score 分别为-249.43，-223.82，-210.34，-245.79 kJ/mol，而Amber score 分别为-131.56，-91.84，-137.30，-191.04 kJ/mol，从能量打分情况来看，与各个靶点均具有较高的亲和力。

对先导化合物与各个靶点氨基酸残基之间的相互作用情况进行分析，它与大肠杆菌PBP1b 的相互作用最少，只有2 个氢键和1 个疏水作用，而与铜绿假单胞菌PBP3 和大肠杆菌PBP4 之间均为4 个氢键和2 个疏水作用，相互作用最多的为大肠杆菌PBP5，共有6 个 疏水作用（SER83，SER84，SER107，LEU150，THR211，GLY212） 和4个 氢键 （SER41，ASN109，ARG245），其中，与ARG245 的胍基可以形成2 个氢键（图2）。这种相互作用数量的多少与Amber score 的能量打分规律完全吻合，即相互作用越多，能量越低，相互作用越少，能量越高。

图2 先导化合物与大肠杆菌PBP5 的相互作用分析Fig.2 Interactions between lead compound and E.coli PBP5

2.5 先导化合物的合成

根据先导化合物的化学结构，首先进行2，4-二氯-6-哌啶基-1，3，5-均三嗪的合成，之后再连接上2 个甘氨酸，具体合成路线如图3所示。

合成产物经纯化后，用甲醇溶解，通过质谱仪进行分子质量测定。如图4所示，合成产物的分子质量为311 u，与先导化合物的理论分子质量一致。

2.6 先导化合物的食品保鲜效果研究

2.6.1 冷鲜肉pH 值的变化研究 以往研究表明，在冷鲜肉的保藏早期，pH 值通常会出现短时间的下降，这主要是因为肌肉中的糖元在无氧条件下发生了酵解，同时ATP 也被缓慢分解，产生了乳酸、磷酸等酸性物质，而随着贮存时间的延长，肌肉中的微生物以及蛋白酶开始分解蛋白质，产生多肽等含氮的碱性物质，pH 值逐渐上升[1，14]，这与本研究的pH 值变化规律一致。

从图5a可以看出，从第3 天开始，先导化合物组的pH 值一直显著低于空白对照组，并在整体上略低于山梨酸钾组，说明先导化合物可以减缓冷鲜肉蛋白质的分解速度，并且效果好于山梨酸钾，与空白对照组相比，大约可以延长3 d 保藏时间。

图3 先导化合物的合成Fig.3 Synthesis of lead compound

图4 先导化合物的质谱分析Fig.4 Mass spectrum analysis of lead compound

图5 冷鲜肉的pH 值（a）、菌落总数（b）、汁液流失率（c）及挥发性盐基氮（d）的变化Fig.5 Changes in pH value （a），total bacterial colonies （b），drop loss （c） and TVB-N （d） of chilled pork

2.6.2 冷鲜肉菌落总数的变化研究 抑制微生物的生长繁殖是延长食品保藏时间的重要方法，微生物数量是判断食品新鲜度的重要指标。从图5b可知，冷鲜肉的菌落总数在贮藏早期均有一个小幅度的下降过程，这与pH 值的变化情况一致，可能由于保藏早期肌糖元分解产生乳酸所致[14]。从第3 天开始，各组保藏样品的菌落总数均呈上升趋势，其中空白对照组的增长速度快，菌落数量显著高于先导化合物组和山梨酸钾组（P<0.05）。而先导化合物和山梨酸钾处理组的菌落增长速度则比较缓慢，说明二者皆可抑制微生物的生长。同时，先导化合物处理组的菌落数一直低于山梨酸钾组，说明先导化合物的抗菌活性要优于山梨酸钾。

2.6.3 冷鲜肉汁液流失率的变化研究 在冷鲜肉保藏期间，随着微生物的生长繁殖，蛋白质等营养成分逐渐被破坏，水分会伴随营养成分流失从组织中渗透出来[1]。从图5c可知，冷鲜肉的汁液流失率随着贮藏时间延长呈上升趋势，尤其是空白对照组，其汁液流失率显著高于先导化合物和山梨酸钾处理组（P<0.05），而先导化合物处理组的汁液流失情况比山梨酸钾处理组稍好，然而差异不显著（P>0.05）。

2.6.4 冷鲜肉挥发性盐基氮的变化研究 挥发性盐基氮（TVB-N）是在食品贮藏过程中因蛋白质分解而产生的一系列碱性物质，通常挥发性盐基氮的含量越高，说明食品中营养成分的损失越多，食品的新鲜度越低[15]。从图5d可以看出，贮藏样品的挥发性盐基氮值均随时间延长呈上升趋势，其中，空白对照组的TVB-N 值显著高于先导化合物和山梨酸钾处理组（P<0.05），说明先导化合物和山梨酸钾均具有抑制蛋白质分解，降低挥发性盐基氮含量的作用。同时，先导化合物组的挥发性盐基氮值略低于山梨酸钾组，表明先导化合物的效果更好一些。

2.6.5 冷鲜肉颜色的变化研究 肉的颜色是衡量其新鲜度的一个重要指标[16-17]，从图6a可知，贮藏样品的L*值均随着时间延长呈下降趋势，其中，空白对照组从第3 天开始L*值出现快速下降，显著低于先导化合物和山梨酸钾处理组 （P<0.05），先导化合物组的L*值下降速度比空白对照组慢，说明其对冷鲜肉具有一定的护色作用，而山梨酸钾组的L*值下降速度最慢，护色效果最好。

各组样品a*值的变化情况如图6b所示，其中，空白对照组a*值从第3 天开始即大幅度下降，显著低于先导化合物和山梨酸钾处理组（P<0.05），而先导化合物和山梨酸钾处理组的a*值从第6 天才开始下降，并且一直显著高于空白对照组（P<0.05），说明二者对保持肉品颜色，延缓红度值下降具有一定作用。另外，各组a*值的总体变化均呈先升后降的趋势，这可能与肌红蛋白的氧化有关，该蛋白与氧气反应后先变成亮红色的氧合肌红蛋白，然后继续与氧气反应，进一步转变成高铁肌红蛋白，红度值降低，从而在整体上a*值呈先增加而后降低的趋势[16-17]。

对各组样品b*值的变化情况也进行了研究，如图6c所示，第3 天开始，各组样品的b*值不断增加，其中空白对照组的上升速度最快，b*值显著高于先导化合物和山梨酸钾处理组 （P<0.05），表明先导化合物和山梨酸钾具有降低冷鲜肉黄度值的功效，并且先导化合物处理组的b*值最低，说明其效果最好。

图6 4 ℃下冷鲜肉的颜色变化情况Fig.6 Color changes of chilled pork during the storage at 4 ℃

3 结论

细菌的粘肽合成酶是与细胞壁合成密切相关的重要蛋白酶，β-内酰胺类抗生素（如青霉素类和头孢菌素类）能够结合这些酶的催化中心，抑制细菌的细胞壁合成，导致细胞壁缺损，细胞膨胀裂解而死亡。

在本研究中，选择了革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和大肠杆菌的多个粘肽合成酶作为虚拟筛选的靶点，以便获得对革兰氏阴性菌具有较好抗菌活性的先导化合物。由于先导化合物靶向细菌的粘肽合成酶，通过破坏细菌的细胞壁合成而发挥抗菌作用，而人和其它动物的细胞没有细胞壁，因此理论上对人体细胞伤害较小。另外，以冷鲜肉为研究对象，研究了先导化合物的食品保鲜能力，通过测定冷鲜肉的pH 值、挥发性盐基氮、汁液流失率、细菌菌落总数和肉的颜色等指标，对先导化合物的保鲜效果进行了评价。研究结果表明，先导化合物处理组的各项指标均显著优于空白对照组（P<0.05），说明它对冷鲜肉具有非常好的保鲜效果。与常用的食品保鲜剂山梨酸钾相比，先导化合物除了护色能力稍差以外，其它各项指标均优于山梨酸钾。

综上所述，通过虚拟筛选获得了结构新颖的先导化合物，该先导化合物可以减缓冷鲜肉的腐败速度，延长保藏时间，展示出了在食品保鲜领域的应用前景。在后续的研究工作中，将选择更多种类的食品来检验这种先导化合物的保鲜效果。此外，通过虚拟筛选，还获得了许多结构新颖的化合物，将从中挑选一些结构较复杂的化合物进行合成，以便获得保鲜效果更好的先导化合物。