斑衣蜡蝉雌性生殖系统超微结构

刘佳宁, 秦道正

(西北农林科技大学植物保护学院, 陕西杨凌 712100)

昆虫的生殖系统是昆虫繁殖后代、延续种族的器官，其构造和功能是研究昆虫生殖能力和适应性的基础，与昆虫种群数量的消长密切相关(彩万志等, 2001; 王荫长, 2004; Klowden, 2008)。研究昆虫生殖系统的超微结构特征，不仅可用于近缘类群的分类鉴定，还可以为系统发育关系探讨提供重要证据。

蜡蝉总科(Fulgoroidea)是半翅目(Hemiptera)头喙亚目(Auchenorrhyncha)中一个较大的类群，目前已记载约1 500属13 600多种，广泛分布于世界各大地理区(宋南和江志毅, 2012; Bourgoin, 2019)。该类群均为植食性，一些种类还可以传播植物病毒病，是农林业生产上的重要害虫(Yangetal., 2015; Zhangetal., 2019)。有关蜡蝉总科昆虫雌性生殖系统的整体形态和超微结构研究较少，目前仅见Ammar(1985)研究了玉米花翅飞虱Peregrinusmaidis卵巢的超微结构，在发育的卵母细胞中发现了类菌体；Bourgoin和Huang(1991)以及Bourgoin(1993)明确了蜡蝉亚目昆虫雌性生殖系统的整体形态；Bourgoin和O′Brien(1994)研究了蜡蝉科中Odontopteratoulgoeti的雌性生殖系统，提供了内部结构形态图；D′Urso等(2005)发现颖蜡蝉科中Cixidiasikaniae每个卵巢有6个卵巢管，卵巢管外有卵巢鞘；Michalik等(2009)和Szklarzewicz等(2007)分别观察了脉菱蜡蝉Cixiusnervosus、古北飞虱Javesellapellucida和Conomelusanceps卵巢的超微结构，发现卵子发生早期的卵母细胞和滋养细胞位于滋养体底部，卵泡上皮细胞环绕卵母细胞排列；林江(2011)和林江等(2011)描述了缘蛾蜡蝉Salurnismarginella、八点广翅蜡蝉Ricaniaspeculum、斑衣蜡蝉Lycormadelicatula和柿广翅蜡蝉Ricaniasublimata雌性生殖系统，并提供了相应的形态特征图。此后，有关蜡蝉总科雌性生殖系统超微结构一直未见报道。

斑衣蜡蝉Lycormadelicatula隶属蜡蝉总科(Fulgoroidea)蜡蝉科(Fulgoridae)斑衣蜡蝉属Lycorma，该种原记载于中国，后扩散至孟加拉国、印度、越南、日本、韩国等其他亚洲国家，主要危害观赏乔木和灌木等(Kimetal., 2013; Yangetal., 2014)。近年来还入侵北美，给当地的葡萄及果树产业带来严重为害(Barringeretal., 2015; Daraetal., 2015)。本研究采用光学显微镜和透射电子显微镜技术，观察斑衣蜡蝉的雌性生殖系统整体形态及超微结构，旨在明确其主要器官的超微结构特征，为蜡蝉总科昆虫分类和交配机制研究提供更多的形态证据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

斑衣蜡蝉L.delicatula成虫于2018年9月采自陕西杨陵(34°29′32″N, 108°6′91″E)，采集的新鲜雌虫标本置于养虫笼内带回实验室迅速活体解剖。

1.2 光学显微镜观察

将活体雌成虫置于2%磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline, PBS)(0.1 mol/L, pH 7.2)的凹面载玻片上，在体视显微镜(型号: Jiangnan JSZ6)下快速解剖出雌性生殖系统的交配囊、前阴道、后阴道、中输卵管、受精囊管、受精囊、卵巢和受精囊附腺等，并移入滴有2%磷酸盐缓冲溶液的凹面皿中，在光学显微镜(型号: Leica M205 A)下观察并拍照。

1.3 透射电子显微镜样品制备与观察

用尖头镊子将解剖并分离的雌性生殖系统各部分器官放入2.5%戊二醛的2.0 mL离心管中，在4℃冰箱中固定12 h后取出，用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)漂洗3次，每次15 min;于1%锇酸溶液4℃条件下固定2 h，再用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)漂洗3次，每次10 min;用梯度乙醇(体积比30%, 50%, 70%, 80%, 90%和100%)进行逐级脱水,各浓度2次，每次8 min；随后在2.0 mL离心管中用乙醇/伦敦白胶(LR White树脂)混合物进行3次渗透(3∶1, 1∶1和1∶3，v/v)，时间分别为2, 8和12 h，再用纯伦敦白胶包埋剂渗透2次，每次24 h。将样品胶囊贴好标签放入包埋板内，进行摇床震荡，最后用纯伦敦白胶包埋剂进行包埋，在55℃烘箱内聚合48 h。

将制作好的胶粒用修块机(型号: Leica EM Trim2)进行样品修整，用Leica EM UC7型超薄切片机进行半薄定位和超薄切片(厚度约为75 nm)，置于80目的铜网上，然后用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色(分别为10和20 min)，在TECNAI G2 SPIRIT BIO型透射电子显微镜80 kV下进行观察和拍照，获取的图片用Adobe Photoshop CS6进一步处理。

2 结果

2.1 雌性生殖系统整体形态

斑衣蜡蝉雌性生殖系统主要包括1对卵巢、1个中输卵管、1个交配囊、1个交配囊管、1个前阴道、1个后阴道、1个受精囊、1个受精管和2根受精囊附腺(图1)。2个卵巢发达对称，呈端滋式。交配囊膨大呈长圆形，下方连接交配囊管，交配囊管再与后阴道相连。前阴道连接后阴道和受精管，受精囊管末端膨起形成椭圆状的受精囊，中输卵管开口于前阴道侧腹部，受精囊附腺细长管状，其一端着生在受精囊尾部，另一端附着在交配囊上。

图1 斑衣蜡蝉雌成虫生殖系统结构

2.2 雌性生殖系统超微形态

交配囊膨大呈圆球状。交配囊的囊壁由上皮细胞、肌肉层和基膜组成(图2: A)。肌肉层呈石块状整齐排列，上皮细胞核明显，具分泌颗粒，细胞层内有大量囊泡结构和少量的基膜内折(图2: A, B)。交配囊的囊腔中可见一些分泌物质和精子(图2: C, D)。

图2 斑衣蜡蝉雌成虫交配囊

交配囊管呈圆柱状，连接交配囊和后阴道，由肌肉鞘、上皮细胞层和管腔组成，上皮细胞核突出，存在基膜内折，微气管连接细胞基膜(图3: A, B)，肌肉鞘内有大量的囊泡结构(图3: C)；横切图显示管壁内微绒毛密集(图3: D)，分布有大量的线粒体和内质网结构(图3: E, F)。

图3 斑衣蜡蝉雌成虫交配囊管

后阴道位于交配囊管下方，圆管状，靠近上皮细胞处的微气管结构连接细胞层(图4: A)。管腔内存在大量微绒毛，其边缘分布有分泌颗粒(图4: B)；大量的分泌颗粒和线粒体环绕于上皮细胞核周围(图4: C, D)。后阴道由上皮细胞层、肌肉鞘和管腔构成(图4: D)。

图4 斑衣蜡蝉雌成虫后阴道

前阴道与后阴道末端相连，管状，端部延伸至中输卵管。前阴道由肌肉鞘、基膜、上皮细胞层和管腔组成，微气管以基膜连接肌细胞层，并形成内折与肌肉鞘相连(图5: A, B)；上皮细胞层内充满囊泡结构(图5: C)，上皮细胞核周围环绕着大量的线粒体结构(图5: D)。

图5 斑衣蜡蝉雌成虫前阴道

中输卵管位于前阴道侧腹部，由中输卵管腔、上皮细胞、肌肉鞘和基膜组成(图6: A)；上皮细胞核周围存在大量线粒体结构，上皮细胞层内充满囊泡结构(图6: B, C)；肌肉层厚且发达，管壁外有微气管，连接肌肉鞘和基膜(图6: D)。

受精管从中输卵管末端延伸至受精囊，上皮细胞间有少量的基膜内折(图7: A)；肌细胞间隙明显且边界清楚，存在囊泡结构(图7: B)；管腔内有大量层状内质网和线粒体结构，以及一些腔内分泌物(图7: C)；肌细胞交错排列，存在层状体(图7: D)，受精管壁由基膜、厚层肌肉鞘和管腔组成(图7: E)。

图7 斑衣蜡蝉雌成虫受精管

受精囊为受精管近末端略膨大的囊状结构，由肌肉鞘、基膜、上皮细胞和囊腔构成，囊壁由较厚的肌肉层组成(图8: A, B)。肌肉鞘细胞间由微气管相连，靠近管腔处为上皮细胞层(图8: A, B)；上皮细胞层边缘环绕大量微绒毛，内部布满线粒体和内质网结构(图8: C, D)。受精囊腔中散布大量精子结构和角质层(图8: E)。

图8 斑衣蜡蝉雌成虫受精囊

卵室由固有膜、滤泡细胞和卵细胞组成(图9: A, B)。中下部的滋养细胞中有合胞体(图9: C)，其细胞核又分化为滋养细胞和卵母细胞的细胞核。卵室内充满形状不规则的滋养细胞，细胞周围存在内共生细菌(图9: C, D)。卵细胞间存在细胞间隙，细胞核外分布着大量线粒体和内质网结构(图9: E)。

图9 斑衣蜡蝉雌成虫卵巢

受精囊附腺着生于受精囊末端，为均匀的螺旋管状，主要由肌肉层、上皮细胞层和中心管腔组成(图10: A)；上皮细胞层内有大量的内质网和圆形分泌颗粒(图10: B)，受精囊附腺管腔内基膜内折，有囊泡结构(图10: C)；分泌细胞前体物质外围环绕一些颗粒物，内部主要是丝状物质(图10: D)。

图10 斑衣蜡蝉雌成虫受精囊附腺

3 讨论

斑衣蜡蝉与蜡蝉总科(Fulgoroidea)中其他已报道类群的雌性生殖系统结构相似，均由卵巢、中输卵管、交配囊、交配囊管、前阴道、后阴道、受精囊、受精管和受精囊附腺等部分构成，但不同类群的卵巢小管数目存在差异，如：中华彩象蜡蝉Dictyopharasinica[隶属象蜡蝉科(Dictyopharidae)]的卵巢有6个卵巢小管，缘蛾蜡蝉S.marginella[隶属蛾蜡蝉科(Flatidae)]有8个卵巢小管，山东宽广蜡蝉Pochaziashantungensis、八点广翅蜡蝉R.speculum、透明疏广蜡蝉Euricaniaclara[隶属广蜡蝉科(Ricaniidae)]有12个卵巢小管(林江, 2011)。本研究观察到斑衣蜡蝉的卵巢由14个卵巢小管组成。可见，雌性生殖系统卵巢小管数目在不同科间有差异。林江(2011)和林江等(2011)观察了斑衣蜡蝉的雌性生殖系统整体结构，本文为了全面起见，也提供了该种雌性生殖系统的整体形态特征图。在此基础上，本研究首次对卵巢、中输卵管、交配囊、交配囊管、前阴道、后阴道、受精囊、受精管和受精囊附腺的超微结构进行了观察和描述。

根据现有研究，半翅目头喙亚目中叶蝉总科(Cicadelloidea)和蝉总科(Cicadoidea)昆虫中输卵管膨大，受精囊及交配囊呈圆形或椭圆形，精子储存在受精囊内(Bourgoin, 1993; Hayashi and Kamimura, 2002; Hummeletal., 2006; 苏梅, 2014)；沫蝉总科(Cercopoidea)昆虫中输卵管中部略微膨起形成交配囊，受精囊退化，精子储存在交配囊中(王婷婷, 2015)；角蝉总科(Membracoidea)昆虫中输卵管基部着生膨大的受精囊，交配囊退化(钟海英, 2014)。蜡蝉总科昆虫的中输卵管短粗，开口于前阴道，下方连接2根侧输卵管，交配囊位于后阴道背面，受精囊位于受精囊管近末端，用于储存精子(Bourgoin, 1993)。本研究发现斑衣蜡蝉的中输卵管、交配囊及受精囊与林江(2011)和林江等(2011)有关广蜡蝉科(Ricaniidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)和象蜡蝉科(Dictyophoridae)代表种类的中输卵管、交配囊及受精囊的形态结构相似，而不同于蝉总科、叶蝉总科和沫蝉总科的种类。这是否是蜡蝉总科昆虫的独有特征需要进一步研究。此外，本研究观察的斑衣蜡蝉受精囊壁的超微结构以及在囊腔内发现单个游离精子，与叶蝉总科和蝎蛉科昆虫Panorpasexspinosa和Panorpajilinensis受精囊壁的组成和囊内的精子分布状态相似(Hayashi and Kamimura, 2002; 马娜, 2012; 苏梅, 2014)，进一步证实了受精囊为昆虫储存精子的重要场所。斑衣蜡蝉交配囊内存在游离精子和分泌物质，说明交配囊是雌雄虫交配的场所，雄虫的精子在交配囊中短暂贮存及活化，这与已报道的头喙亚目昆虫以及其他类群交配囊结构功能一致(Hayashi and Kamimura, 2002; Hummeletal., 2006; 王婷婷, 2015)。

雌性昆虫常具雌性附腺和受精囊附腺(Leopold and Degrugillier, 1973; Leopoldetal., 1978; Degrugillier, 1985; 彩万志等, 2001)。半翅目头喙亚目中叶蝉总科和沫蝉总科雌成虫雌性附腺为1根粗细均匀的管状结构，与交配囊相连，受精囊附腺不发达(苏梅, 2014; 王婷婷, 2015)；蝉总科雌成虫雌性附腺着生于侧输卵管基部，受精囊附腺极长(钟海英, 2014)；角蝉总科雌成虫雌性附腺2根，粗长，受精囊附腺1根，基半部细于端半部(Tsai and Perrier, 1996; 钟海英, 2014)。本研究中斑衣蜡蝉受精囊附腺为2根螺旋管，连接在受精囊末端，附着在交配囊上，雌性附腺结构退化，这与蜡蝉总科中颖蜡蝉科(Achilidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、广蜡蝉科(Ricaniidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)及象蜡蝉科(Dictyopharidae)雌成虫雌性附腺和受精囊附腺的结构组成(Bourgoin, 1993; Bourgoin and O′Brien, 1994; D′Ursoetal., 2005; 林江, 2011)一致。可见头喙亚目中不同总科雌成虫雌性附腺与受精囊附腺的形态特征存在明显区别。这些形态特征差异是否可以作为该亚目高级阶元划分的依据，仍有待进一步探讨。

在雌性生殖系统超微结构方面，本研究观察的斑衣蜡蝉中输卵管由中输卵管腔、上皮细胞、肌肉鞘和基膜组成，且肌肉层发达，这与叶蝉总科中黑尾叶蝉Bothrogoniaferruginea、玻璃叶蝉Homalodiscacoagulata、横线叶蝉Exitianusnanus、条沙叶蝉Psammotettixstriatus和槭锥顶叶蝉Japananushyalinus中输卵管的超微结构(Hayashi and Kamimura, 2002; Hummeletal., 2006; 苏梅, 2014)大体一致，但斑衣蜡蝉中输卵管上皮细胞层内未发现微绒毛和分泌颗粒；此外，斑衣蜡蝉交配囊囊壁由上皮细胞、肌肉层和基膜组成，上皮细胞层内有囊泡和基膜内折，这与沫蝉总科中牧草长沫蝉Philaenusspumarius、陕西尖胸沫蝉Aphrophorashaanxiensis和四斑象沫蝉Philagraquadrimaculata交配囊结构(王婷婷, 2015)相似，但上皮细胞层中未发现黑色颗粒物。斑衣蜡蝉与其他头喙亚目昆虫雌性生殖系统超微结构是否还存在更多差异，也需要进一步深入研究。