绿原酸对美国白蛾幼虫生长发育和解毒相关蛋白活性的影响

潘忠玉, 莫夏娜, 孟 香, 陈 敏

(北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室, 北京 100083)

昆虫与植物在长期协同进化中形成了相对稳定的生态关系。植物为植食性昆虫提供营养物质的同时，也进化出一系列物理和化学防御机制来抵抗昆虫的取食。其中，植物次生代谢物在抵御昆虫的取食中发挥着重要作用(钦俊德和王琛柱, 2001; Rani and Jyothsna, 2010; Gong and Zhang, 2014)。植物次生代谢物质种类多样，而酚类是植物重要的次生代谢物质之一(徐正浩等, 2004)。不少研究证明，一些植物酚类次生代谢物质如绿原酸、单宁酸等会对昆虫的取食、生长、发育以及繁殖等活动产生不利影响，有的甚至具有直接毒杀作用(张时妙等, 2005; 王晓丽等, 2014)。

在长期的协同进化过程中，昆虫也形成了行为、生理生化等机制来应对植物次生代谢产物的胁迫，如不少昆虫在代谢过程中就能够以不同的解毒机制对抗寄主植物中的有毒物质(Felton and Tumlinson, 2008; 朱香镇等, 2018)。已有的研究表明，昆虫解毒相关蛋白主要有细胞色素P450酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP450)、羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GSTs)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)、ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)[简称ABC转运蛋白(ABC transporters)]等(Francisetal., 2005; Winde and Wittstock, 2011; Jinetal., 2018)，这些解毒相关蛋白通过参与外源有毒物质的分解和代谢，从而使昆虫产生适应性(Zhangetal., 2012)。

美国白蛾Hyphantriacunea，属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)，是我国重要的检疫性害虫。该虫原产北美洲(Gomi, 2007; Sullivanetal., 2011)，自1979年在辽宁省丹东市首次被发现后，目前已经扩散至我国13个省(区、市)共计598个县级行政区(国家林业局2020年第3号公告)。美国白蛾寄主广泛，多达630余种(Sullivan and Ozman-Sullivan, 2012)。我们前期研究发现，不同寄主植物对美国白蛾有明显的影响，该虫对桑Morusalba、金银木Loniceramaackii等不同寄主植物的取食量、选择率和营养效应不同，取食不同寄主植物的美国白蛾幼虫体内的AchE, GSTs, CarE和 CYP450 的活性也存在显著差异(李路莎等, 2018)。我们认为，寄主植物的次生代谢物可能在其中发挥重要作用，然而，不同寄主植物所含次生代谢物质的种类组成及含量各异，逐一研究明确各种次生代谢物的影响往往存在较大困难。

绿原酸(chlorogenic acid, C16H18O9, 分子量354.31)属正双羟基酚类化合物，是植物中常见的一种次生代谢物，从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道(高锦明等, 1999)。绿原酸在美国白蛾的喜食寄主桑中的含量较低(0.39%～1.02%)(孙莲等, 2003; 郝静怡等, 2019)，在其非喜食的寄主植物金银木中含量则较高(3.366%)(朱成姣等, 2016)，在非寄主植物杜仲Eucommiaulmoides中含量可高达4.07%(张康健等, 1999)，这寓示绿原酸在影响美国白蛾对寄主植物的取食策略中可能发挥着重要作用。目前已有研究表明绿原酸对昆虫的生长发育产生不利影响，甚至可在昆虫体内可被氧化为毒性更高的醌类物质，对昆虫产生直接毒杀作用(胡增辉等, 2009; Kundu and Vadassery, 2019)。王晓丽(2014)发现舞毒蛾Lymantriadispar幼虫取食含有单宁酸、绿原酸的人工饲料后不能完成正常的生长发育，幼虫体重比对照低约67.2%～75.0%，幼虫历期延长2～4倍，蜕皮受阻，至4龄时全部死亡。谷实夜蛾Helicoverpazea在摄取含绿原酸和咖啡酸人工饲料后，发育历期明显延长(Summers and Felton, 1994)。舞毒蛾幼虫取食含绿原酸人工饲料后羧酸酯酶CarE活性随着时间呈现递减趋势，但始终比取食正常人工饲料的酶活性强(刘海晶, 2016)。然而，有关绿原酸对美国白蛾生长发育和生理代谢的影响尚不得而知。有鉴于此，本研究通过在人工饲料中添加不同浓度的绿原酸饲养美国白蛾幼虫，比较和分析绿原酸对该虫营养效应、生长发育和解毒相关蛋白活性的影响，以期为深入探究美国白蛾的寄主适应机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试虫及饲养条件

研究中所用的美国白蛾试虫为实验室人工饲养种群。将美国白蛾初孵幼虫转入含有人工饲料的养虫杯中，置于昆虫培养箱内(温度25±1℃，相对湿度73%，光周期16L∶8D)饲养。美国白蛾人工饲料配制以及饲养条件采用曹利军等(2014)。

1.2 人工饲料及绿原酸浓度处理设置

根据文献报道中美国白蛾不同寄主植物中的绿原酸浓度，其喜食寄主植物桑中浓度为0.39%～1.02%，非喜食寄主金银木中浓度为3.366%(孙莲等, 2003; 朱成姣等, 2016; 郝静怡等, 2019)，则研究中设置人工饲料中绿原酸的浓度梯度(m/m)分别为0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%。制作人工饲料期间，将所有主要材料在液态条件下混合(约65℃)，将0.4 g绿原酸(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%)用5 mL 10%二甲基亚砜(DMSO)于室温下溶解后，加入15 g人工饲料中配置成2.000%绿原酸人工饲料，相同方法配制其余浓度绿原酸饲料，以添加5 mL 10% DMSO的人工饲料为对照组。

1.3 不同浓度绿原酸处理美国白蛾幼虫的死亡率测定

根据美国白蛾特性，5龄幼虫食量大，生长发育旺盛，且肠道易于解剖，适宜进行试验测定。选取生长发育一致的5龄健康幼虫，饥饿12 h后转入不同浓度(0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)的绿原酸人工饲料饲养。以10% DMSO人工饲料饲养的5龄健康幼虫为对照。每个养虫杯接虫10头幼虫为一个重复，每浓度处理设4个重复(即4个养虫杯)。饲养条件同1.2节。每天观察饲料是否新鲜，不新鲜的及时更换，并记录幼虫死亡情况，为避免老熟幼虫出现预化蛹状态影响试验结果，于处理6 d后终止观察并统计数据。以毛笔轻触美国白蛾幼虫虫体两次，无反应者视为死亡。死亡率(%)=(死亡幼虫个体数/供试幼虫总数)×100%。

1.4 不同浓度绿原酸处理美国白蛾的营养效应测定

选取生长发育一致的5龄健康幼虫，饥饿12 h后，转入不同浓度的绿原酸人工饲料(0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)饲养，以10%DMSO人工饲料饲养的5龄健康幼虫为对照。饲养条件同1.2节。每个培养杯接虫5头为一个重复，每浓度处理设3个重复。

幼虫取食前称取人工饲料重量，48 h后取出剩余饲料，饥饿12 h后使幼虫排出粪便，称取取食后幼虫的鲜重。然后将幼虫、粪便、剩余饲料放入烘箱，80℃下烘干至恒重，分别称量其干重。此外，在相同环境下，另外采集取食前人工饲料和刚饥饿处理后的5龄幼虫，称取鲜重，进行烘干，记作取食前饲料干重和取食前幼虫干重。根据饲料含水量和幼虫含水量推算取食前幼虫以及投喂饲料干重。依照下列公式计算各营养指标(Waldbauer, 1968)：

近似消化率(AD)(%)=(I-F)/I×100%；

食物利用率(ECI)(%)=G/I×100%；

食物转化率(ECD)(%)=G/(I-F)×100%；

相对生长速率(RGR)(g/g·d)=G/(B×T)；

相对取食量(RCR)(g/gd)=I/(B×T)。

式中，G: 虫体增重(G=取食后幼虫干重-取食前幼虫干重);B: 试验期间幼虫平均体重[B=(取食前幼虫干重+取食后幼虫干重)/2];I: 取食量(I=取食前饲料干重-取食后饲料干重);F: 粪便干重;T: 试验天数。

1.5 0.500%绿原酸处理美国白蛾幼虫的生长发育指标测定

参照王晓丽等(2014)的方法，以及预试验结果，美国白蛾低龄(1和2龄)幼虫对绿原酸非常敏感，即使采用较低浓度的绿原酸(0.250%)，试虫均很快死亡，无法完成各项生长发育指标的数据采集，所以将生长发育一致的3龄健康幼虫饥饿12 h后，转入含0.500%绿原酸的人工饲料饲养，同时设置含10% DMSO的人工饲料饲养的3龄幼虫作对照组。每30头幼虫(饲养于一个养虫杯)为一个重复，每处理设3个重复，处理前称量每个处理的幼虫平均体重，第一次蜕皮后，将幼虫转移到新的养虫杯内，一杯1虫，单头饲养。饲养条件同1.2节。每天观察并记录幼虫的发育情况，包括蜕皮、化蛹、死亡等。羽化后，将雌雄成虫转移到纱网笼内进行自由交配、产卵，对卵块进行计数。

1.6 不同浓度绿原酸处理美国白蛾的解毒相关蛋白活性测定

选取生长发育一致的5龄健康幼虫，饥饿12 h后，转入含0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%的绿原酸人工饲料饲养(饲养条件同1.2节)，以含10% DMSO人工饲料饲养的5龄幼虫为对照。每个养虫杯接虫5头为一个重复，每个处理设3个重复。饲养36 h后，随机挑选试虫进行解剖，取出肠道，用预冷的磷酸缓冲液(pH 7.0)，按中肠质量(g)∶磷酸缓冲液体积(mL)=1∶9(m/v)的比例进行冰浴匀浆，4℃ 8 000 r/min离心10 min后，取上清即为酶原液4℃保存，用于分析食料中不同浓度的绿原酸对美国白蛾幼虫各解毒相关蛋白活性的影响。

用谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)测定试剂盒(YX-W-A204，上海优选生物科技有限公司)、羧酸酯酶(CarE)测定试剂盒(ml036265，上海酶联生物科技有限公司)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)测定试剂盒(ml062849)、ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)测定试剂盒(ml341674)、细胞色素P450酶测定试剂盒(JL22832，上海将来实业有限公司)测定肠道酶源液5种解毒相关蛋白活性；用蛋白浓度测定试剂盒(PW0103, BIOMIGA, 美国)测定肠道酶源液蛋白浓度。各解毒相关蛋白活性和蛋白定量测定的具体方法均按照相应试剂盒说明书进行。

1.7 数据分析

运用SPSS21.0软件计算美国白蛾幼虫在绿原酸处理下的死亡率、营养效应指标、生长发育各项指标、解毒相关蛋白活性的平均值和标准误，采用独立样本t检验和单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析，以Tukey氏检测法比较不同处理间的差异显著性(P<0.05)，运用Origin8.0软件绘图。

2 结果

2.1 绿原酸对美国白蛾5龄幼虫死亡率的影响

用含不同浓度绿原酸的人工饲料饲喂美国白蛾5龄幼虫6 d后的死亡率结果见图1。结果表明，含不同浓度绿原酸的人工饲料饲养美国白蛾5龄幼虫，3 d后开始出现死亡个体，死亡高峰期出现在第3-5天之间；6 d后不同浓度绿原酸处理的美国白蛾幼虫死亡率有显著差异(F=48.634,P<0.05)，且绿原酸浓度越高，幼虫的死亡率越高，0.125%绿原酸处理组死亡率为10.00%±4.08%，而2.000%绿原酸处理组死亡率达到67.50%±4.79%。

图1 取食含不同浓度绿原酸的人工饲料后美国白蛾5龄幼虫的死亡率

2.2 绿原酸对美国白蛾5龄幼虫营养效应的影响

不同浓度绿原酸处理48 h后的美国白蛾5龄幼虫的营养效应指标见表1。结果显示，不同浓度绿原酸处理的美国白蛾5龄幼虫的相对取食量(RCR)和近似消化率(AD)显著高于对照组(P<0.05)，食物转化率(ECD)显著低于对照组(P<0.05);除0.125%绿原酸处理组外，其余浓度处理组幼虫的食物利用率(ECI)和相对生长速率(RGR)也显著低于对照组(P<0.05)。

表1 取食含不同浓度绿原酸的人工饲料48 h后美国白蛾5龄幼虫的营养效应指标

2.3 绿原酸对美国白蛾幼虫生长发育的影响

用含0.500%绿原酸的人工饲料饲养美国白蛾幼虫(从3龄幼虫开始)，各龄期发育历期情况如表2。结果表明，与对照组相比，0.500%绿原酸处理使3-5龄幼虫的发育历期显著延长28.24%(3.7 d)(P<0.05)，但6和7龄幼虫的发育历期缩短8.97%(0.7 d)，整体延长3-7龄幼虫的发育历期约3.0 d。

表2 0.500%绿原酸对美国白蛾幼虫发育历期的影响

0.500%绿原酸处理后美国白蛾的其他各项生长发育指标如表3所示。结果显示，绿原酸处理组的幼虫总存活率(66.67%)、化蛹率(90.00%)、成虫羽化率(81.49%)和雌雄性比(0.29)均明显低于对照组，且平均单雌产卵量(429.60±65.35粒)比对照(707.33±26.78粒)显著减少(P<0.05)。由此可知，绿原酸对美国白蛾的生长发育和繁殖具有负面影响。

表3 0.500%绿原酸对美国白蛾5项生长发育指标的影响

2.4 绿原酸对美国白蛾5龄幼虫解毒相关蛋白活性的影响

用含5种不同浓度(0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)绿原酸的人工饲料分别饲养美国白蛾5龄幼虫36 h后，肠道内5种解毒相关蛋白的活性如图2所示。结果表明，不同浓度的绿原酸对美国白蛾GSTs(F=97.577,P<0.001)、UGT(F=6.421,P=0.004)、CYP450(F=2.471,P<0.001)和ABC转运蛋白(F=5.761,P=0.006)的活性均有显著影响。由图2(A, D, E)可知，绿原酸对美国白蛾中肠的ABC转运蛋白, CYP450和GSTs活性均有不同程度的诱导作用且诱导趋势相似。随着绿原酸浓度的升高，ABC转运蛋白、CYP450和GSTs 3种解毒相关蛋白的活性也逐渐升高，然后略微降低。当绿原酸浓度低于0.250%时，CYP450酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)；绿原酸浓度为0.500%～2.000%时，CYP450酶的活性被显著诱导，在1.000%时活性达到最大(12.46 U/L)。在试验浓度范围内GSTs活性均被显著诱导，在绿原酸浓度为1.000%时GSTs活性达到最大(34.21 U/mg pro)。在试验浓度内ABC转运蛋白活性也被不同程度诱导且与对照组差异显著，当绿原酸浓度为0.500%时，对ABC转运蛋白的活性诱导能力达到最大。0.125%的绿原酸对美国白蛾UGT的活性具有显著诱导作用(P<0.05)，而其余浓度处理的UGT活性与对照相比均无显著差异(P>0.05)(图2: B)。而由图2(C)可知，各浓度绿原酸对美国白蛾幼虫CarE活性均未见显著影响(F=0.166,P=0.970)。

图2 取食含不同浓度绿原酸的人工饲料36 h后美国白蛾5龄幼虫肠道中5种解毒相关蛋白的活性

3 讨论

本研究通过在美国白蛾人工饲料中添加不同浓度的绿原酸，调查了绿原酸对美国白蛾幼虫死亡率、营养效应指标和多项生长发育指标的影响，以及不同浓度绿原酸对美国白蛾5龄幼虫5种解毒相关蛋白活性的影响。绿原酸处理组美国白蛾幼虫3 d后才开始有个体死亡，死亡高峰期在第3-5天之间(图1)，说明绿原酸在本研究的试验浓度范围内对美国白蛾不具有急性杀虫作用，但随着取食时间延长，绿原酸可能在幼虫体内积累而发挥杀虫作用。王晓丽等(2014)用0.3%绿原酸处理舞毒蛾2龄幼虫也得到类似结果，处理20 d后幼虫死亡率从20%迅速上升到50%，到34 d时死亡率达到100%；其他酚类如50 μg/mL山奈酚处理72 h后致倦库蚊Culexquinquefasciatus4龄幼虫死亡率达到82%(黄继光等, 2014)。

本研究结果表明，绿原酸处理对幼虫的营养效应指标具有显著影响，处理组5龄幼虫的相对取食量和近似消化率显著高于对照组，但是食物转化率、食物利用率和相对生长速率显著低于对照组(表1)。可能由于绿原酸的存在致使美国白蛾对营养物质的利用率降低，从而影响其生长发育。Barbenhenn等(2003)也提出，绿原酸在许多鳞翅目幼虫中肠的碱性、氧化的环境内，可对其生长发育产生不利影响，可能是由于绿原酸被昆虫的过氧化物酶氧化成氯醌后与氨基酸(组氨酸、半胱氨酸等)结合，降低氨基酸的生物利用度，从而抑制昆虫的生长(Kundu and Vadassery, 2019)。研究表明，酚酸物质与营养素或酶结合时，对虫体消化吸收有不利影响(Appel, 1993)。如谷实夜蛾在摄取定量香豆酸后，相对生长速率显著降低(Summers and Felton, 1994)。斜纹夜蛾Spodopteralitura取食1%没食子酸后，食物利用率显著降低(黄敏燕和李雪峰, 2018)。本研究中绿原酸处理使美国白蛾幼虫的相对取食量和近似消化率上升(表1)，表明美国白蛾可通过提高取食量和食物的消化率来补偿对食物营养利用率低的影响，满足其生长发育的营养需求，从而对食物中一定浓度绿原酸产生适应性反应。

本研究中用0.500%绿原酸处理的饲料喂食美国白蛾3龄幼虫，使该虫化蛹率、羽化率、雌雄性比以及单雌产卵量降低(表3)，表明食物中的绿原酸可对美国白蛾的生长发育及繁殖造成负面影响。绿原酸导致美国白蛾幼虫(3-5龄)龄期延长，可能是因为美国白蛾在抵御绿原酸的过程中产生了适合度代价，摄入的能量一部分用于生长发育，而另一部分则消耗用于绿原酸的解毒代谢，而老熟幼虫(6-7龄)的发育历期缩短，可能与美国白蛾倾向于以蛹度过不良环境，绿原酸处理导致老熟幼虫提前化蛹等有关(邓煜, 2018)。本研究绿原酸降低美国白蛾生长发育和繁殖力结果与Osier等(2000)研究舞毒蛾的产卵量与其食料的含酚酸量成反比的结论相一致，这为Awmack和Leather(2002)提出的昆虫在长期进化的过程中可通过调节自身的繁殖能力来适应不同适合度的食物的推测提供了新的证据。

植物次生代谢产物可以诱导植食性昆虫解毒相关蛋白活性发生变化，从而可能提高这类昆虫的适应能力(Hlavica, 2011; 陈澄宇等, 2015)。本研究结果表明，绿原酸在供试浓度范围内能够诱导美国白蛾幼虫的细胞色素P450酶的活性(图2)。已有研究证实CYP450酶能在昆虫消化道等组织内为有毒次生代谢物质引入羟基、羧基和氨基等化学基团，提高有毒次生代谢物质的水溶性和反应活性，降解为毒性更低的形式(Chungetal., 2006; Cuietal., 2016)。供试浓度范围内的绿原酸能够一定程度上诱导美国白蛾GSTs活性。GSTs通过催化还原性谷胱甘肽(GSH)与有毒的疏水亲电物质发生轭和反应，使之毒性降低，可溶性增强而排出体外，从而达到解毒的目的(Firidinetal., 2008)。羧酸酯酶具有广泛的底物特异性，可以水解羧酸酯键、酰胺键和硫酯键，在对含酯键外源毒物的水解方面起重要作用，也可以作为结合蛋白与外源毒物不可逆结合，使其不能达到靶标，从而起到对外源毒物的隔离作用(Hemingway, 2000)。绿原酸对舞毒蛾幼虫体内羧酸酯酶CarE活性起诱导作用(刘海晶, 2016)，但本研究结果表明绿原酸对美国白蛾CarE活性没有显著影响(图2)，表明不同昆虫对绿原酸的解毒响应机制不同，美国白蛾通过诱导其他解毒相关蛋白的活性来抵御绿原酸危害。本研究中低浓度的绿原酸对UGT活性有诱导作用，但相对高浓度绿原酸对UGT活性没有显著影响；绿原酸对美国白蛾ABC转运蛋白生物活性的影响是随着浓度的增加而呈现先升高后略微降低趋势(图2)。ABC转运蛋白主要在解毒过程第3阶段起作用，排出由CYP450和GSTs等解毒相关蛋白活化共轭连接的毒素复合物(Jinetal., 2018)。这些结果表明，绿原酸对美国白蛾幼虫体内不同解毒相关蛋白生物活性的影响存在差异，绿原酸的解毒代谢可能需要不同解毒相关蛋白的协调作用才能完成。

本研究针对绿原酸对美国白蛾死亡率、营养效应指标、生长发育的影响以及解毒相关蛋白活性的影响进行研究，发现绿原酸可影响美国白蛾幼虫利用食物营养的效率以及解毒相关蛋白的活性，同时也对美国白蛾幼虫的生长发育、行为、繁殖等生命活动以及子代种群数量产生不利影响，而美国白蛾幼虫可以通过调节食物的取食量和消化率以及诱导活化解毒相关蛋白的活性，增强对绿原酸的代谢能力，从而对寄主植物中一定含量的绿原酸产生适应。本研究将有助于揭示绿原酸的抗虫作用机制，以及美国白蛾对含绿原酸的寄主植物的选择和适应策略，对于制定和完善美国白蛾的防治策略具有重要的指导作用。