优质囊胚形成时间对妊娠结局的影响

闫雪，徐兴华(通信作者)

1 天津和睦家医院生殖中心 (天津 300221)；2 山东第一医科大学组胚教研室 (山东泰安 271000)

在一定的胚胎选择标准下，单胚胎移植也可获得稳定的临床妊娠率和累计妊娠率，并且可明显降低多胎妊娠的风险[1-2]。相较于卵裂期胚胎，囊胚移植具有更好的临床结局[3]。近年来，越来越多的生殖中心采用单囊胚移植技术。在囊胚培养过程中，相同评分的囊胚可能形成时间不一致。囊胚形成时间的差异是否会影响解冻移植的妊娠结局目前尚存有争议[4]。本研究旨在分析月经规律女性改良自然周期解冻移植单个优质D5或D6囊胚的妊娠结局，以期为解冻胚胎移植策略的制定提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年8月至2019年6月在天津和睦家医院行冻融单囊胚移植的93名女性的临床资料。93名女性在体外受精-胚胎移植(invitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治疗开始前均经过医院伦理委员会批准通过，且签署囊胚培养及冷冻知情同意书。纳入标准：(1)取卵日女性年龄<38岁，基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)值<10 IU/ ml且抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)>1.1 ng/ml；(2)月经周期规律，排卵正常，月经不规律包括月经稀发、频发、闭经、异常子宫出血等；(3)取卵周期采用标准长方案或拮抗剂方案超促排卵；(4)子宫内膜准备方案为人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)诱发排卵的自然周期方案，解冻移植周期HCG子宫内膜厚度≥7 mm；(5)解冻复苏后囊胚扩张，且为单个优质囊胚移植周期。排除标准：(1)既往诊断为子宫畸形、宫颈机能不全、黏膜下子宫肌瘤及宫腔粘连等；(2)既往诊断为子宫腺肌病、子宫内膜异位症；(3)夫妻任一方存在染色体核型异常，不包括染色体多态性；(4)存在未处理的输卵管积水；(5)既往诊断为多囊卵巢综合征；(6)既往有反复妊娠丢失史；(7)患有甲状腺功能低下、糖尿病等内分泌疾病未纠正；(8)存在辅助生殖技术及妊娠禁忌证。

1.2 方法

1.2.1 分组

根据囊胚的冷冻时间分为2组，将移植胚胎为D5冻存的囊胚定义为D5组(70名)，将移植胚胎为D6冻存的囊胚定义为D6组(23名)。

1.2.2 囊胚培养与评分

在受精后第3天，将胚胎转至囊胚培养液G2(vitrolife，瑞典)进行囊胚培养。D5和D6分别观察囊胚形成情况。囊胚评分参考Gardner评分系统。根据囊腔的扩张程度划分囊胚的分期，共分为1～6期。1期，囊腔体积未超过胚胎总体积50%；2期，囊腔体积大于胚胎总体积50%；3期，囊腔占满整个胚胎体积；4期，囊胚扩张、透明带变薄；5期，囊胚开始孵化；6期，囊胚完全孵出。对3～6期的囊胚行进一步的内细胞团(inner cell mass，ICM)评分，A：细胞数目多，排列紧密，碎片少；B：细胞数目较少，结合较松散；C：细胞数目极少，难以辨认。同时，行外滋养层(TE)评分，A：细胞数量>10，大小均匀；B：细胞数量为10，大小不均；C：细胞数量<10，大小不均，存在碎片。本中心冷冻囊胚标准为3期以上且内细胞团及外滋养层评级均在B级以上的囊胚。

1.2.3 囊胚冷冻及复苏

将所有囊胚采用玻璃化冷冻技术进行冷冻。冷冻及复苏操作均参考Vitrolife(瑞典)玻璃化冷冻、解冻试剂盒说明书进行。在解冻后，囊胚培养3～24 h进行移植，解冻后2 h依据囊胚腔是否重新扩张来判断囊胚是否存活。若胚胎未存活，重新解冻1枚囊胚。

1.2.4 子宫内膜准备

采用改良自然周期，于患者月经第9或10天开始行B超监测，若卵泡直径>14 mm时，隔日行B超监测，之后每日定时监测尿黄体生成素(luteinizing hormone，LH)；若卵泡直径>16 mm时连续监测LH；当卵泡直径≥17 mm、子宫内膜厚度≥7 mm时，皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素250 μg，排卵后第5天行解冻移植。

1.2.5 囊胚移植及黄体支持

嘱患者保持膀胱充盈，在腹部B超引导下移植1枚D5或D6冷冻的优质囊胚，若患者有多个胚胎冻存，优先移植D5胚胎，且优先移植胚胎评分最优的胚胎。

1.2.6 随访

新生儿在出生后1～2个月内由专人通过电话对患者进行随访。随访内容包括出生孕周、生产方式、出生体质量、出生身长、性别、有无畸形、母亲是否患妊娠期合并症等。

1.2.7 结局判断及观察指标

临床妊娠的标准为移植30 d后经B超观察到孕囊或流产病理证实有绒毛组织；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植囊胚周期数×100%。流产的标准为在孕28周之前，胎儿体质量低于1 000 g的妊娠终止；活产的标准为妊娠满28周及以上的活胎分娩；早产的标准为妊娠满28周但不足37周的活胎分娩。早期流产率=妊娠12周内流产的周期数/临床妊娠周期数×100%。活产率=活产周期数/移植周期数×100%。早产率=早产周期数/活产周期数×100%。对于疑似异位妊娠的患者，需密切观察，一经确诊应尽早处理。

1.3 统计学处理

2 结果

D5冻融囊胚移植与D6冻融囊胚的生化妊娠率、临床妊娠率、流产率、早产率、活产率、男女比例、剖宫产率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。而D6囊胚移植出生的新生儿体质量及身长明显高于D5囊胚，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组均无畸形儿出生，D5囊胚移植组有1名孕妇患妊娠期糖尿病，见表1～2。

表1 D5、D6冻融囊胚移植周期患者的基本资料比较

表2 两组活产新生儿妊娠结局比较

(续表)

3 讨论

本研究发现，D5与D6优质囊胚的生化妊娠率、临床妊娠率、流产率、早产率、活产率、男女比例、剖宫产率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。有多数研究的结果与上述结果一致。有研究指出，冻融周期单个优质囊胚移植在不同年龄段、不同发育时间(D5、D6)均可获得较好的临床妊娠结局[5]。有学者指出，35周岁以下女性在单个优质冻融囊胚移植周期中，D5囊胚的临床妊娠率、种植率、早期流产率、继续妊娠率与D6比较，差异无统计学意义；即使在移植2个优质冻融囊胚周期中，D5组的各项指标与D6组比较，差异均无统计学意义[4]。考虑可能的原因为在囊胚形成过程中，无论是D5还是D6囊胚均具有相同的整倍体率[6]；而非整倍体是导致胚胎凋亡、种植失败或自然流产的主要因素。在冻融单囊胚移植时，若移植胚胎为优质囊胚，则囊胚形成时间对于妊娠结局(生化妊娠率、临床妊娠率、早期流产率、活产率、早产率)无显著影响；但当移植囊胚为低质量囊胚时，囊胚形成时间对妊娠结局有显著影响，D5形成的囊胚移植后妊娠结局明显优于D6囊胚[7]。

本研究结果发现，来源于D6的囊胚出生婴儿的体质量及身长均较D5胚胎增加。既往有研究指出，无论是来源于D5还是D6的优质囊胚解冻移植周期中出生的活产儿各项指标如早产率、足月产率及低出生体质量等均无差异。有研究指出，D5与D6单囊胚解冻移植活产的新生儿出生体质量比较，D6的新生儿出生体质量有增加的趋势，但与D5相比较差异无统计学意义[8]。在调整了孕妇年龄、BMI、产次、不孕年限、胚胎质量等偏倚因素后，仍发现D6囊胚出生的新生儿中巨大儿发生率明显增高[9]。但最近发表的一篇Meta分析也得出了与本研究相同的结论[10]。考虑可能随着胚胎培养时间的延长，在表观遗传学方面可能对胚胎产生了影响，从而导致出生婴儿体质量及身长的增加。

综上所述，在冻融单囊胚移植时，若移植胚胎为优胚，则囊胚形成时间对于临床结局无显著影响，但来源于D6囊胚的新生儿与D5相比身长及体质量有明显增加。考虑到人工周期解冻移植较其他解冻方案会增加女性妊娠期高血压的发生率[11]，故本研究只纳入月经规律妇女，仅采用改良自然周期一种方案解冻移植，以尽可能地减少孕妇因素对妊娠结局的影响，较以往研究分类更加细致。但本研究为回顾性研究，具有一定的局限性，且样本量较小，今后将进行大样本的前瞻性研究验证。