轻型颅脑损伤患者血清miR-16 和miR-92a 的表达变化与预后的相关性研究

潘长福 ，段景丽 ，何燕 ，翁中海 ，余兆祥

（景德镇市第一人民医院1.神经外科；2.急诊科，江西 景德镇 333000）

创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury， TBI）是一类严重危害人类生命和健康的疾病。 据估计，我国脑外伤患者发病率为每年150～120/10 万人[1]，其中轻型颅脑损 （mild traumatic brain injury， mild TBI）占比高达 75～90%[2]。 对于绝大多数轻型颅脑损伤患者而言，伤后无需特殊治疗即可在数周至数月内恢复正常。 但约20%患者仍遗留有脑创伤后综合征，如头痛、头昏、失眠、记忆力下降、焦虑、抑郁等，严重影响其正常工作和学习[3，4]。 尽管人们对轻型颅脑损伤越来越重视，但对其诊断与预后判断仍缺乏有效手段。 在过去的几十年中，许多蛋白分子被认为是有价值的颅脑损伤生物学标志物，如GFAP、NSE、UCH-L1、MBP 和S100B 等[5，6]。 然而，大部分蛋白分子对影像学正常的轻型颅脑损伤患者敏感性很低，迄今为止，还没有任何蛋白类标志物运用于临床[7]。 MicroRNAs (miRNA)为内源性非编码单链小分子RNA，在转录后水平调节基因表达，参与调控多种生物学过程[8-11]。目前有研究发现，多种miRNA 在脑外伤后血清内表达水平发生明显变化，具有潜在的生物学诊断价值[7，9，12]。 本文拟检测轻型颅脑损伤患者血清miR-16 和miR-92a 的表达变化，探讨其对轻型颅脑损伤患者诊断与预后评估的生物学价值。

1 资料与方法

1.1 资料收集 依据格拉斯哥评分 （Glasgow Coma Scale，GCS）系统，可以将创伤性颅脑损伤分为轻型GCS13～15 分、中型 GCS9～12 分和重型 GCS3～8 分[13]。 本研究收集 2018 年 6 月至 2018 年 12 月于景德镇市第一人民急诊外科和神经外科救治的轻型颅脑损伤患者GCS 评分13～15 分。病例判断标准：⑴患者年龄＞18 岁，＜75 岁， 无合并其它系统损伤及既往无心、脑系统重大疾病史；⑵头部外伤12h以内；⑶入院时GCS 评分13～15 分，且入院后GCS评分无降低；⑷排除受伤前患者有饮酒、使用毒麻和镇静药物、精神、智力异常；⑸入院前未使用任何药物治疗者。 本研究经医院医学伦理委员会批准，并取得患者及家属知情同意。

1.2 分组 入院时所有患者均于急诊使用荷兰飞利浦64 排128 层螺旋CT 进行头颅扫描。 将颅骨及颅内未见明显外伤性改变患者视为颅脑CT 阴性48 例。 发现以下任何情况均视为颅脑CT 结果阳性：单纯颅骨骨折8 例、颅骨骨折合并硬膜外血肿6 例、硬膜下血肿6 例、蛛网膜下腔出血8 例、脑挫裂伤4 例。共收集患者80 例，将32 例颅脑CT检查结果阳性者列为A 组，48 例颅脑CT 检测结果阴性者列为B 组。 将同期本院体检健康成人40例列为对照组。 三组人员性别、年龄差异无统计学意义（P＜0.01）。

1.3 标本采集 脑外伤患者入院后未行药物治疗前留取静脉血5 ml，健康体检者于空腹时留取静脉血，离心后血清置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 miR-16 和 miR-92a 检测 采用 trizol 试剂盒提取血清内总RNA；以PrimeScript TM RT reagent kit 逆转录 RNA 为 cDNA，反应条件：42℃ 15min，85℃ 5s。 采用 miScript Primer Assays、miScript SYBR Green PCR Kit 反应体系，使用ABI 7500 real-time PCR system 中进行扩增反应。 反应条件：95°C，10min；95°C，15s，60°C，60s，40 个循环。 采用 U6 作为内参，健康体检者血清为对照，用2-ΔΔCt表示基因的相对表达量。

1.5 GOSE 评分 所有患者于伤后6 个月进行GOS E 评分。 GOSE 评分分为 8 个等级：8 为恢复良好；7为恢复良好， 伴有轻微的身体和智力缺陷；6 为中等残疾， 恢复以前的工作但需要一些调整；5 为中等残疾，低水平的工作；4 为严重残疾，依赖他人，可以做一些日常活动；3 为严重残疾， 日常活动完全依赖他人；2 为植物状态；1 为死亡。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0 软件进行统计学分析。 计量资料以均数±标准差（±s）表示。 多组间均数比较采用单因素方差分析，两组均数间比较采用小样本t 检验。 采用Spearman 分析血清miR-16、miR-92a 表达量和 GOS-E 评分相关性。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 脑外伤A 组、B 组和对照组年龄、性别差异无统计学意义；脑外伤A 组和B 组受伤至入院采血时间差异无统计学意义。 见表1。

2.2 各组血清miR-16 和miR-92a 表达量比较 脑外伤A 组和B 组miR-16 的表达量均明显高于对照组，且脑外伤A 组miR-16 的表达水平明显高于脑外伤 B 组。 同样， 脑外伤 A 组和 B 组 miR-92a的表达量均明显高于对照组，且A 组miR-16 的表达水平明显高于B 组。 见图1。

表1 脑外伤A、B 组和对照组的一般临床资料

2.3 血清miR-16 和miR-92a 表达量与脑外伤患者伤后6 个月GOSE 评分的关系 Spearman 预后分析表明，脑外伤患者血清miR-16 和miR-92a 表达量与其预后呈负相关， 血清内miR-16 和miR-92a 表达量越高， 其预后越差 （r=-0.74、-0.65，P＜0.05）。 同样，颅脑 CT 阳性 A 组患者和颅脑 CT 结果阴性B 组患者血清内miR-16 和miR-92a 表达量均与其预后呈负相关（r=-0.82、-0.75；r=-0.72、-0.69，P＜0.05）。 见表2。

图1 Real-time PCR 结果显示脑外伤 A 组和 B 组miR-16 和miR-92a 表达水平均明显高于对照组（*P＜0.01）；A 组 miR-16 和miR-92a 表达水平明显高于 B 组（#P＜0.01）

表2 血清miR-16 和miR-92a 表达量与脑外伤患者伤后6 个月GOSE 评分的关系

3 讨论

目前轻型颅脑损伤诊断主要依据GCS 评分和影像学检查，但二者皆有其特定的局限性。 GCS 评分无法适用于复合伤、饮酒、使用镇静剂、精神、智力异常等患者[14]。 CT 扫描是患者入院时首选检查方法，但敏感性较低，大多数轻型颅脑损伤患者影像学检查无异常表现。 磁共振成像可以提高对微小病灶的检出率，但对设备要求高，费用高昂，外伤早期很难安排，限制了其广泛使用[5]。因此寻找微创、快捷、价格低廉的生物学标志物，对于轻型颅脑损伤的诊断与治疗具有重大意义。 目前，大量研究发现，许多蛋白分子，如 GFAP、NSE、UCH-L1、MBP 和S100B 等， 在脑外伤患者血清内含量明显增加，并与脑外伤严重程度及预后相关[5]。 但是由于蛋白类分子标志物分子量大， 通过血脑屏障困难，特别是对于影像学正常的轻型颅脑损伤患者而言，特异性和敏感性很低。 因此，迄今为止，还没有任何蛋白类标志物运用于临床[5]。

miRNA 为小分子单链RNA，很容易通过血脑屏障，且在体液内含量丰富、性质稳定，人们已开始研究其在肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等疾病诊断中的生物学标志物价值[8]。 同样，miRNA作为脑外伤潜在的生物学标志物也引起人们重视。如 2010 年，Redell 等采用 RT-PCR 技术检测 10位重型颅脑损伤患者和10 位轻型颅脑损伤患者外周血108 个miRNA 的表达水平，以正常成人和矫形外科创伤患者作为对照，结果发现轻、重型颅脑损伤患者外周血miR-16 和miR-92a 均发生明显变化[12]。 2016 年，Bhomia 等采用 miRNA 芯片检测轻、重型颅脑损伤患者血清和脑脊液标本，以矫形外科创伤组和健康人群作为对照，发现miR-451、 miR-20a 和 miR-92a 等 miRNA 在轻、 重型颅脑损伤患者血清和脑脊液内均表达明显上调[7]。 同样，周小龙等发现，轻、中、重型创伤性颅脑损伤患者血清内 miR-93、miR-191、miR-499 表达水平均显著性上升， 且治疗后临床疗效好患者血清miR-93、miR-191 和miR-499 水平显著低于临床疗效差的患者[15]；薛全生等发现，脑外伤后，轻、中、重型颅脑损伤患者血清内 miR-93、miR-191 和 miR-499 表达水平也均明显升高，且重型颅脑损伤组患者表达最高[16]。 以上研究表明，miRNA 作为一种潜在的生物学标志物，可能在脑外伤诊断与损伤程度评估中具有重要意义。

本研究检测了轻型颅脑损伤患者伤后早期血清内miR-16 和miR-92a 的表达变化。 结果发现，与健康体检者比较， 脑外伤4h 后CT 阳性患者和CT 阴性患miR-16 表达量分别为对照组的6.36 倍和 4.25 倍，miR-92a 的表达量分别为对照组的4.48 倍和 3.07 倍，均显著增高。 Redell 等报道，在其研究中， 轻型颅脑损伤患者脑损伤后10h 内，血清内miR-16 和miR-92a 均上升 2.3 倍，与本研究结果类似；同样，Bhomia[7]等检测了轻型颅脑损伤患者伤后24h（平均时间为3.1h）血清内mi-92a 的表达水平， 结果发现其表达水平为健康对照组的3.77 倍，显著上调，同样与本研究结果类似。 本研究还发现颅脑 CT 阳性患者血清内 miR-16 和miR-92a 表达量比颅脑CT 阴性患者表达量明显升高，提示脑外伤患者血清miR-16 和miR-92a 表达变化具有潜在的诊断价值。 此外，本研究发现，轻型颅脑外伤预后欠佳者（GOSE 评分＜8 分）血清miR-16 和miR-92a 表达水平较预后良好（GOSE评分8 分）者明显增高，提示血清miR-16 和miR-92a 表达变化可作为轻型颅脑损伤预后的潜在生物学指标。 然而由于本研究纳入研究样本量相对较少，且miR-16 和miR-92a 在脑外伤中的具体功能及作用机制尚不明确，仍需要进一步研究。

综上所述，本研究发现轻型颅脑损伤患者血清内miR-16 和miR-92a 表达水平升高，可作为轻型颅脑损伤诊断与预后的生物学标志物，具有潜在的临床应用价值。