两广地区3 株猪非典型瘟病毒的流行及遗传演化分析

2020-11-10王小茹

中国预防兽医学报 2020年9期

王小茹，闫鹤

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510641）

猪非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus，AP⁃PV）是一种无囊膜、单股RNA 病毒，属于黄病毒科（Flavivridea）瘟病毒属（Pestivirus）成员[1]。APPV 基因组全长10.8 kb～11.5 kb，包含一个开放阅读框（Open read frame，ORF），编码病毒的多聚蛋白，包括4 个结构蛋白（C、Erns、E1 和E2）和8 个非结构蛋白（Npro、 P7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A 和NS5B）[1]。2015 年，Hause 等利用宏基因组测序技术，首次在猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性猪血清样品中发现APPV[2]。随后，Arruda 等[3]和Groof 等[4]通过动物回归试验证实APPV 可以引起仔猪先天性震颤（Congenital tremors，CT）。APPV 作为一种新发病原，不仅可以在CT 病猪中检出，其还可以引起猪的隐性和持续性感染，导致猪群反复出现CT 病症[2,4-5]。迄今，APPV 已在4 大洲15 个国家被报道[1]，该病毒与CT 高度相关，是全球养猪业的一个新威胁。

目前，APPV 在我国出现新的变异，广东、江西和安徽出现新基因型APPV[6-7]。本研究于2017 年～2018 年采集两广地区两个规模化养殖场10 份CT 病料样品进行APPV 检测，采用RT-PCR 方法扩增了其中3 份APPV 阳性病料样品的ORF 基因序列，并分析了其与GenBank 中登录的60 株APPV 的ORF、E2和P7 基因序列的同源性及遗传进化关系，为揭示APPV 在中国的流行情况及其基因多样性，以及后续对该病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 10 头患有CT 的仔猪病料样品（每头猪都采集了脑、肺、心脏、肾、脾和淋巴结样品）于2017 年～2018 年采自两广地区2 个规模化猪场，病猪临床表现为全身震颤、行走困难、无法吮吸初乳。PBS 缓冲液（pH 7.4）购自赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自QIAGEN 公司；One-step RT-PCR kit、pMD19-T 载体、DH5α 感受态细胞、DL2000 DNA Marker 和Mini⁃BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA 公司。

1.2 病料样品检测与APPV ORF 基因的RT-PCR扩增及测序将每头猪的所有组织样品剪取0.5 g 混合后加入PBS 缓冲液，研磨、离心后取上清液，按照试剂盒说明书提取总RNA。以各病料样品提取的RNA 为模板，利用APPV 检测引物[6]，按照One-step RT-PCR kit 试剂盒说明书进行检测。选取阳性样品，参考文献[6]采用10对引物分段扩增APPV的ORF基因序列[6]。PCR 产物由华大基因测序，利用DNAStar 7.1软件拼接后获得APPV ORF全长基因序列。

1.3 APPV ORF 基因及其包含的E2 和P7 基因序列的同源性及遗传演化分析利用DNA Star7.1 软件，将本研究中的3 株APPV 的ORF 基因及ORF 基因包含的E2 和P7 基因序列与GenBank 登录的60 株国内外APPV 参考株相应基因序列进行同源性分析，采用MEGA7.0 软件（Neighbor-Joining method，bootstrap值为1 000）软件构建该3 种基因的遗传进化树，分析APPV 的遗传进化关系。

2 结果与讨论

2.1 病料样品与APPV ORF 基因的RT-PCR 扩增、测序结果利用APPV 检测引物对两广地区2 个猪场的10 份病料样品进行APPV RT-PCR 检测，结果显示10 份样品均为APPV 阳性。从上述10 份AP⁃PV 阳性样品中选出3 份，采用RT-PCR 分段扩增经拼接后获得3 株APPV 的ORF 全长基因序列，长度均为10 908 bp，编码3 635 个氨基酸。来源于广西猪场的2 株APPV 分别命名为GX-GL1 和GX-GL67，来源于广东猪场的1 株APPV 命名为GD-CT4，3 株APPV 的ORF 基因序列上传至GenBank，获得登录号分别为MN584738、MN584739 和MN584737。

2.2 APPV ORF 基因及其编码氨基酸序列的同源性及遗传演化分析结果利用DNAStar 7.1 软件对AP⁃PV 的ORF 基因及其编码的氨基酸序列进行同源性分析。结果显示，3 株APPV 之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为81.6%～99.8%和91.4%～99.9%；与41 株中国参考株的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为80.8%～99.3%和90.5%～99.6%；与19 株国外参考株的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为81.3%～91.1%和90.8%～96.3%。GX-GL1株、GX-GL67株均与广西GX01 株（MH715893）和贵州GZ01 株（KY475592）的同源性最高（核苷酸序列同源性分别为98.6%、98.5%；氨基酸序列同源性均为99.3%）；GD-CT4株与广东GD-MH01 株（MH493894）同源性最高（核苷酸序列同源性为99.3%，氨基酸序列同源性为99.6%）。结果表明，本研究获得的3 株APPV 均与中国参考株的同源性最高。

ORF 基因的进化树结果显示，APPV 分为3 种基因型，与近期的其它研究结果一致[6-7]。GX-GL1株和GX-GL67 株属于基因1 型，与基因1 型贵州GZ01 株（KY475592）同属于一个分支且亲缘关系最近；而GDCT4 株属于基因3 型，与基因3 型广东GD-MH01 株（MH493894）聚为一个分支（图1）。广西有基因1型AP⁃PV流行，而广东3 种基因型的APPV 均有流行[6]。从地理分布来看，基因1型APPV分布最广泛，在中国及其它6个国家（奥地利、德国、荷兰、韩国、瑞士、美国）均有流行，而基因2型和3型APPV仅出现在中国；从发现时间来看，基因1型APPV可追溯至2006年，基因2 型APPV 可追溯至2016 年，基因3 型APPV 最早出现在2017 年。可见APPV 在世界各国的猪群中均有传播并不断进化，但在中国APPV却呈现出多样性。

2.3 APPV E2 和P7 基因的同源性及遗传演化分析结果 E2 基因编码APPV 主要保护性抗原蛋白[2]。E2基因与其编码的氨基酸序列同源性分析显示，GXGL1株和GX-GL67株均与云南SWU-YB株（MH499646）的同源性最高（核苷酸序列同源性98.5%，氨基酸序列同源性98.3%），与安徽AH-SG-2018.01 株（MK216751）同源性最低（核苷酸序列同源性80.8%，氨基酸序列同源性88.4%）；与国外参考株核苷酸序列的同源性为87.1%～91.7%，氨基酸（MH493894）同源性为89.2%～95%。GD-CT4 株与广东GD-MH01 株（MH493894）和GD-BZ01 株（MH493896）的E2 基因序列同源性最高（核苷酸和氨基酸序列同源性均为100%），与外国参考株中的德国GER-01 株（LT594521）同源性最高（核苷酸序列同源性82.8%，氨基酸序列同源性92.9%）（图2A）。总之，E2 基因的同源性分析显示，3 株APPV 均与国内APPV 的同源性更高。

P7 基因编码病毒孔蛋白，该蛋白可以运输离子和其它分子通过宿主细胞膜，有助于病毒进入细胞及其在细胞中的成熟[2]。APPV P7 基因的同源性分析结果显示，3 株APPV 与60 株参考株的核苷酸序列的同源性为74.5%～100%，氨基酸序列的同源性为61.3%～100%。3 株APPV 均与四川SWU-ZH 株（MH499647）P7 基因氨基酸序列同源性最低（<70%）（图2B）。猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CS⁃FV）的P7 蛋白与毒力相关[8]，APPV 的P7 蛋白变异是否会影响APPV 的毒力还需进一步研究。

图1 APPV ORF 基因的遗传进化树Fig. 1 Phylogenetic tree based on ORF gene sequences of APPV

为了进一步确定经ORF 基因鉴定的APPV 的基因分型结果，本研究对APPV 的E2 和P7 基因进行了遗传进化分析。E2 和P7 基因的遗传进化树结果均显示，GX-GL1 株和GX-GL67 株属于基因1 型且与基因1 型的2 株广西株（MH715893、KY652092）、1 株四川株（MH499645）、1 株云南株（MH499646）和1 株贵州株（KY475592）聚为一个分支；而GD-CT4 株属于基因3 型，与基因3 型的3 株广东株（MH493894、MH493895、MH493896）聚为一个分支。63 株APPV在E2 和P7 基因的遗传进化树中的分型结果与ORF基因序列分型结果基本一致，这表明当前所有已鉴定的APPV 可分为3 个基因型，分别是基因1 型、2型和3 型。