鼠伤寒沙门氏菌双组分系统arcB 基因缺失株的构建及药物敏感性分析

武珊珊，敬文宪，陈启伟，李学瑞，刘永生

（中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046）

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）是引起人和动物感染的重要食源性致病菌[1]，宿主广泛，主要寄生于肠道，能引起各种畜禽发生急性/慢性或隐性感染。近些年，由于抗生素广泛及长期使用，使该菌耐药性严重增加，已成为严重威胁人类健康及食品安全的公共卫生问题[2]。

双组分系统是一种信号转导途径，普遍存在于原核生物和真核生物中，在细菌适应环境变化中起着重要作用，是其适应外界刺激的一种机制[3]。该系统与细菌的致病性、耐药性、群体感应、生物被膜形成、毒力因子表达等多种生物学功能密切相关。Arc 双组分系统是一种复杂的信号转导系统，研究表明其在细菌能量代谢的调节中起着重要作用[4]。该系统由组氨酸激酶ArcB 和同源响应调节因子ArcA 组成。其中，ArcB 是一种三联膜相关传感器激酶，包含3 个细胞质结构域，一个具有保守His292残基的末端发射结构域（H1），一个具有保守Asp576残基的中心接收结构域（D1）和一个C 末端替代蛋白具有保守His717残基的发送器结构域（H2）[5]。在缺氧环境刺激下，传感器激酶ArcB 消耗ATP 经过His292→Asp576→His717途径发生自身磷酸化，磷酸化的ArcB 在Asp54处催化ArcA 的转磷酸化，从而抑制与有氧代谢有关基因的转录，并激活与厌氧代谢相关基因的转录[4-6]。而在有氧条下，ArcB 发挥磷酸酶的功能，催化ArcA 的去磷酸化，从而阻断其相应的转录调控作用[7]。该系统调节鼠伤寒沙门氏菌的细胞代谢、生物合成和运动性[8]。之前多以研究arcB基因的结构以及Arc 双组分系统在呼吸及能量代谢中的正反馈或负反馈作用为主，但该系统在鼠伤寒沙门氏菌耐药性方面的作用还未见相关报道。因此，本实验通过构建Arc 系统组氨酸激酶基因arcB缺失株，研究该基因对鼠伤寒沙门氏菌生长特性及药物敏感性等的作用，初步探究Arc 系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响，为深入研究该系统对该菌的耐药机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 鼠伤寒沙门氏菌CVCC541，购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌Trans-T1 感受态细胞购自Transgen Biotech 公司；温度敏感型质粒pKD46、pCP20、pKD4 由李干武老师惠赠；质粒pSTV28 购自TaKaRa 公司。

LB 培养基、MH 培养基、氨苄青霉素（100 mg/mL）、卡那霉素（50 mg/mL）、氯霉素（50 mg/mL）购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶DpnI 购自Promega公司；2 000 bp DNA Marker、250 bp DNA Ladder Marker、Primer STAR Max Premix（2×）、质粒小提试剂盒、DNA纯化试剂盒及胶回收试剂盒均购TaKaRa 公司；pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 购自Transgen Biotech 公司。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank 登录的鼠伤寒沙门氏菌arcB基因序列（SL1344_RS17190），利用Primer 5.0软件设计特异性鉴定引物、arcB基因敲除引物、回复引物以及点突变引物。其中arcB-F/arcB-R为鉴定引物，用于鉴定arcB基因缺失株；arcB-H1P1/arcB-H2P2 为敲除引物（H1、H2 代表arcB基因上下游各45 bp的同源臂；P1、P2代表kan+基因通用引物）用于扩增含arcB基因同源臂的kan+基因片段；引物k2/kt用于检测插入的kan+基因；引物arcB-F/kt 和k2/arcBR 用于检测kan+基因插入的位置。利用Primer 5.0 软件筛选arcB基因中不含且切割效率高的限制性内切酶，设计回复株引物arcB-EcoR I-F/arcB-BamH I-R。引物均由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成，引物序列见表1。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 重组菌pKD46/CVCC541 的构建及其感受态细胞的制备 将温度敏感性质粒pKD46电转至CVCC541菌株中，构建重组菌株。将该菌于30 ℃摇床培养至OD600nm为0.2 左右时，加入终浓度为30 mmol/L 的L-阿拉伯糖，诱导pKD46/CVCC541 菌株中重组辅助蛋白Gam、Beta 和Exo 的表达，当菌液电转OD600nm为0.6左右时，立即冰浴30 min，随后离心收集菌体，按照常规方法制备pKD46/CVCC541 感受态细胞[9]。

1.4arcB基因缺失株的构建与鉴定 以pKD4 为模板，利用敲除引物arcB-H1P1/arcB-H2P2 PCR 扩增含kan+的arcB-pKD4 片段，经DpnI 酶切消除模板pKD4 的干扰，胶回收后电转入pKD46/CVCC541 感受态细胞中，在Gam、Beta 和Exo 3 个λ 噬菌体重组酶作用下发生同源重组，重组产物CVCC541ΔarcB::kan经引物arcB-F/R、arcB-F/kt、k2/arcB-R、k2/kt鉴定后，将其制备成感受态细胞，将温度敏感型质粒pCP20 电转入该重组菌中，利用质粒pCP20 中的FLP 重组酶消除kan+基因，通过含氯霉素抗性LB 平板筛选阳性克隆，通过PCR 鉴定后划线于LB 平板上纯化，最后利用arcB-F/R 引物经PCR 和测序鉴定后将其命名为CVCC541ΔarcB。

1.5arcB基因回复株的构建与鉴定 以CVCC541 基因组为模板，将基因arcB的完整ORF 及上游423 bp、下游543 bp 的序列利用回复引物arcB-EcoR I-F/arcB-BamH I-R PCR 扩增后回收纯化酶切，克隆至pSTV28 载体中构建重组表达质粒pSTV28-arcB，测序鉴定后将正确的pSTV28-arcB重组质粒电转入CVCC541ΔarcB感受态细胞中，同时将质粒pSTV28也电转入CVCC541ΔarcB感受态细胞中，在后续实验中作为质粒空白对照，以消除质粒对实验结果的影响。随后在含氯霉素的LB 平板上筛选阳性克隆，利用引物RV-M/M13-47 和arcB-F/R 分别对上述构建的重组菌经PCR 和测序鉴定，将鉴定正确的菌株分别命名为CVCC541ΔarcB/parcB、pSTV28/CVCC541 ΔarcB。

1.6arcB基因点突变株的构建与鉴定 本实验利用无缝克隆和重组技术构建arcB基因点突变株。将arcB基因的关键位点His292、Asp576、His717突变成丙氨酸（Ala）。以CVCC541基因组为模板，利用点突变引物arcB-pSTV28-F1/arcBHis292-R1、arcBHis292-F2/arcBpSTV28-R2 PCR 扩增含质粒pSTV28BamH I 酶切末端同源片段和含His292Ala 点突变位点的arcB基因片段（片段1 和片段2）；引物arcB-pSTV28-F1/arc⁃BAsp576-R1、arcBAsp576-F2/arcB-pSTV28-R2 PCR 扩增含质粒pSTV28BamH I 酶切末端同源片段和含Asp576Ala 点突变位点的arcB基因片段（片段1 和片段2）；引物arcB-pSTV28-F1/arcBHis717-R1、arcBHis717-F2/arcB-pSTV28-R2 PCR 扩增含 质粒pSTV28BamH I 酶切末端同源片段和含His717Ala 点突变位点的arcB基因片段（片段1 和片段2）。将上述扩增的片段1 和片段2 经胶回收后通过多片段体外同源重组方法[10]连接到经BamH I 酶切后的质粒pSTV28 中，构建各点突 变 质 粒pSTV28-arcBHis-292-Ala、pSTV28-arcBAsp-576-Ala、pSTV28-arcBHis-717-Ala，各质粒经PCR 和测序鉴定正确后将其分别电转入CVCC541ΔarcB感受态细胞中，在含氯霉素的LB 平板上筛选阳性克隆，利用引物RV-M/M13-47 和arcB-F/R 经PCR 鉴定后，将鉴定正确的重组菌株命名为arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、ar⁃cBHis-717-Ala。

1.7 各菌株生长曲线的测定 参照文献[11]，挑取

CVCC541、 CVCC541ΔarcB、 CVCC541ΔaarcB/parcB、

arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala及arcBHis-717-Ala菌株单克隆至LB 培养基中，37 ℃200 r/min 培养，每小时取样一次，每次设置3 个重复，连续测定14 h 内细菌的OD600nm值，记录结果并绘制各菌株生长曲线。生长曲线试验重复3 次。

1.8 各菌株最小抑菌浓度（MIC）的测定 参照微量稀释法进行各菌株药物敏感性测定和结果判定[12]。测定菌株CVCC541、CVCC541ΔarcB对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素的MIC；测定亲本株CVCC541、缺失株CVCC541ΔarcB、回复株CVCC541ΔarcB/parcB及点突变株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala对氨基糖苷类抗生素的MIC 值。在96 孔板每孔中加入100 μL MH 培养基，然后在第一孔中加入100 μL 抗生素（512 μg/mL），依次2 倍倍比稀释至第10 孔，第11孔加入100 μL MH 培养基作为阴性对照，第12 孔加入100 μL 菌液作为阳性对照。将制备好的菌液以每孔100 μL 加入，混匀后37 ℃培养16 h～18 h，观察结果。药敏试验重复3 次。

2 结 果

2.1arcB基因缺失株的构建与鉴定结果 以质粒pKD4 为模板，利用引物arcB-H1P1/arcB-H2P2 经PCR 扩增出含有kan+基因的PCR 产物arcB-pKD4，将其电转入CVCC541/pKD46 菌株中，构建重组菌株CVCC541ΔarcB::kan，利用4对引物经PCR鉴定该重组菌。结果显示，分别获得大小为2 007 bp、1 378 bp、1 100 bp、471 bp 的重组片段（图1A），而亲本菌株扩增出了2 865 bp 的arcB基因片段，表明正确构建了重组菌株CVCC541ΔarcB::kan；将其电转化pCP20质粒中构建arcB基因缺失株CVCC541ΔarcB，利用arcB-F/R 引物对其经PCR 鉴定，结果显示该菌株扩增出约为591 bp 的目的条带（图1B），测序结果显示扩增序列正确且被kan+基因替换的arcB基因已去除，表明正确构建缺失株CVCC541ΔarcB。

2.2arcB基因回复株CVCC541ΔarcB的构建与鉴定结果 将含arcB基因的完整ORF 及上游423 bp、下游543 bp 序列的回复株采用2 对引物分别经PCR鉴定。结果显示，利用引物RV-M/M13-47 扩增出3 033 bp 的两端含有酶切位点的arcB基因片段；利用引物arcB-F/R 扩增的2865 bp 的arcB基因片段和591 bp的arcB基因缺失片段，与预期结果一致（图2），同时利用引物RV-M/M13-47 鉴定质粒pSTV28 电转入CVCC541ΔarcB的重组菌株，扩增出150 bp 的质粒片段（图略），测序结果显示扩增序列正确。表明正确构建回复株CVCC541ΔarcB/parcB及质粒对照菌株pSTV28/CVCC541ΔarcB。

2.3arcB基因点突变株的构建与鉴定结果 以CVCC541 基因组为模板，利用点突变引物arcBpSTV28-F1/arcBHis292-R1、arcBHis292-F2/arcB-pSTV28-R2分别扩增出大小为1 438 bp、1 720 bp的arcBHis-292-Ala片段1 和片段2；利用引物arcB-pSTV28-F1/arc⁃BAsp576-R1、arcBAsp576-F2/arcB-pSTV28-R2 分别扩增出大小为2289 bp、868 bp 的arcBAsp-576-Ala片段1 和片段2；利用引物arcB-pSTV28-F1/arcBHis717-R1、arcBHis717-F2/arcB-pSTV28-R2分别扩增出大小为2712 bp、445 bp 的arcBHis-717-Ala片段1 和片段2；将各片段1 和2 纯化后一起分别克隆至经BamH I 酶切后的质粒pSTV28 中构建各突变质粒pSTV28-arcBHis-292-Ala、pSTV28-arc⁃BAsp-576-Ala、pSTV28-arcBHis-717-Ala。将 经PCR 和 测序 鉴定正确的各突变质粒电转入CVCC541ΔarcB中，筛选的阳性克隆分别经2 对引物鉴定。结果显示，利用引物RV-M/M13-47 分别从3 个突变菌株中扩增出3 303 bp 的arcB基因点突变片段；利用引物arcBF/R 分别从3 个突变菌株中扩增出2 865 bp 的arcB基因点突变片段和591 bp 的arcB基因缺失片段，均与预期一致（图3），测序结果显示扩增序列正确。表明正确构建点突变株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala。

图3 各arcB 基因点突变菌株的PCR 鉴定结果Fig. 3 PCR identification results of each arcB gene point mutation strain

2.4 各菌株生长曲线的测定结果 测定了亲本株、缺失株、回复株及arcB基因点突变株在14 h 内的OD600nm值，绘制生长曲线。结果显示，缺失株CVCC541 ΔarcB及点突变株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala生长速度较亲本株CVCC541 变慢，在最初的0～2 h内，缺失株及点突变株与亲本株的生长速率大致相同，在3 h～6 h 内，缺失株与点突变株的生长速率有所下降，在7 h～14 h 内，缺失株与点突变株的生长速率与亲本株趋于一致；而回复株生长速率恢复，与亲本株一致（图4）。表明arcB基因缺失和其关键位点突变后使CVCC541 菌株的生长速率变慢，arcB基因或者其关键位点可能对鼠伤寒沙门氏菌的生长代谢有一定的影响。

图4 各菌株的生长曲线Fig. 4 Growth curve of each strain

2.5 各菌株药敏试验结果

2.5.1 亲本株和arcB基因缺失株对各类抗生素的MIC 测定结果 利用微量肉汤稀释法测定亲本株和arcB基因缺失株对各类抗生素的MIC。结果显示，与亲本株相比，arcB基因缺失株对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素的敏感性无变化，但对氨基糖苷类链霉素、阿米卡星、庆大霉素的耐药性分别增加16、8、4 倍（表2），表明arcB基因主要影响鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性，使其对这类抗生素的耐药性均增加。

2.5.2 各菌株对氨基糖苷类抗生素的MIC 测定结果

根据第一次药敏试验结果，利用微量肉汤稀释法进一步测定各菌株对氨基糖苷类抗生素的MIC。结果显示，缺失株CVCC541ΔarcB对氨基糖苷类药物敏感性均有不同程度的降低，对链霉素、妥布霉素、庆大霉素的耐药性增加8 倍，对阿米卡星、新霉素、奈替米星、卡那霉素的耐药性增加4 倍，对大观霉素的耐药性未发生变化，而回复株则表现出与亲本株相似的药物敏感性，质粒对照菌株pSTV28/CVCC541ΔarcB对抗生素的敏感性与arcB基因缺失株一致，表明质粒pSTV28 对药物试验结果无影响；各arcB基因点突变株与arcB基因缺失株药物敏感性一致（表3）。表明ArcB 关键位点影响其介导的鼠伤寒沙门氏菌CVCC541 对氨基糖苷类药物的耐药性。

表2 亲本株和缺失株对5 类抗生素的MIC 测定结果Table 2 MIC determination results of the parental strain and the deleted strain against 5 types of antibiotics

表3 各菌株对氨基糖苷类抗生素的MIC 测定结果Table 3 MIC determination results of various strains for aminoglycoside antibiotics

3 讨 论

本研究通过Red 同源重组技术构建了arcB基因缺失株和arcB基因回复株，并通过无缝克隆和重组技术构建3 株arcB基因关键位点点突变株，检测了各菌株的体外生长速率及对抗菌药物的敏感性。Red 同源重组技术已普遍应用于大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌及铜绿假单孢杆菌等多种微生物中[13]，但其在实际操作中因菌株差异而使得敲除条件有所不同。参照文献[14]，本实验在同源片段的长度、L-阿拉伯糖的浓度及诱导时间、感受态细胞的状态及浓度以及电转条件等方面进行了试验。文献报道的大肠杆菌arcB基因的同源臂长度为56 nt，本实验所用鼠伤寒沙门氏菌arcB基因的同源臂长度为45 nt，这样不仅重组效率高还节省了引物合成成本；该研究报道的用于诱导pKD46 质粒3 个重组蛋白表达的L-阿拉伯糖的浓度为100 mmol/L，诱导时间为90 min，本实验通过设置不同浓度（30 mmol/L、50 mmol/L、70 mmol/L、100 mmol/L）的L-阿拉伯糖诱导重组菌3 个重组蛋白的表达，通过电转后阳性克隆的转化效率最终确定了重组菌pKD46/CVCC541 最佳诱导浓度为30 mmol/L。当菌液OD600nm为0.6 时，制备该重组菌的感受态细胞最佳。因此确定诱导pKD46/CVCC541 重组菌中3 个重组蛋白表达的最佳诱导时间为1 h。还通过试验确定了将pKD46 电转化至CVCC541 菌中的最佳电转条件为2.3 kv，2.5 ms。

生长曲线结果显示arcB基因缺失和其关键位点突变变后使得CVCC541 菌株生长速率变慢，影响了其体外生长。当缺失arcB基因后，可能影响了arcB基因调控的下游响应调节因子arcA 的磷酸化，使得ArcAB 系统信号转导通路中断[15]。而His292、Asp576、His7173 个位点是arcB基因关键的功能位点，突变这3 个位点后，使得arcB基因自磷酸化和调节ArcA 的磷酸化功能丧失[5]，因而产生了与缺失arcB基因后的重组菌生长变慢的一致结果。因此，缺失arcB基因或点突变arcB基因关键位点后其生长受影响，可能的作用机制是该缺失或突变直接或间接影响了ArcAB 系统的信号转导，从而影响了与重组菌生长相关的基因的表达。

药敏试验结果表明缺失arcB基因后，缺失株对氨基糖苷类抗生素抗性有不同程度的提高，但对其他类抗生素的敏感性无影响。研究表明大肠杆菌生物被膜形成和双组分系统（TCS）信号转导均增加了该菌对氨基糖苷类药物的耐药性[16-17]。细菌对氨基糖苷类药物耐药机制主要与其外膜蛋白改变、药物核糖体靶标修饰、氨基糖苷钝化酶的修饰及外排泵等相关[18]。而目前外排泵已经成为抗生素耐药性的决定因素，其过表达后可导致细菌产生多重耐药性[19]。已知ArcAB 系统在能量代谢和呼吸控制方面具有重要作用[4]，而细菌体内外排泵需要消耗能量将抗生素及有害物质等排出体外，从而使细菌产生耐药性。因此可推测ArcAB 双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌氨基糖苷类抗生素耐药性调控可能与其对能量代谢的调控相关。

Arc双组分系统中的arcB基因点突变株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala对氨基糖苷类抗生素的耐药性增加，与arcB基因缺失株对氨基糖苷类药物抗性增加结果一致。近些年对arcB基因结构的研究已取得很大进展，通过对其结构的解析明确了arcB基因中的关键作用位点，为其功能的研究提供了理论支持。研究表明His292、Asp576、His717位点是arcB自身磷酸化途径所必需的，且His292是arcB基因自动磷酸化的位点[5]。这些功能位点的缺失与arcB基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌氨基糖苷类药物耐药性调控产生的结果一致，进一步证实了His292、Asp576、His717位点对arcB基因功能的重要性，也表明arcB基因对氨基糖苷类药物耐药性调控可能与其磷酸化状态相关。

虽然不同双组分系统之间可能存在相互串扰作用[16,20]，进而对鼠伤寒沙门氏菌的生物学特性产生影响，但与arcB基因缺失株和该基因点突变株相比，回复株对氨基糖苷类抗生素的药物敏感性恢复，与亲本株一致，表明arcB基因突变导致的鼠伤寒沙门氏菌药物敏感性的变化确实是由该基因引起的。目前对ArcAB 系统的研究主要集中在其对细菌的能量代谢及呼吸控制方面，而对其耐药性的相关作用的研究较少。通过本实验可认为arcB基因确实通过某种未知的机制调控鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性，但具体机制还需进一步试验探究。综上所述，本研究结果表明，arcB基因参与鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素耐药性的调控，不只是以往文献报道的与该菌的能量或呼吸代谢相关。因此，本实验为arcB基因的生物学功能提供了一个新的研究方向。