猪流行性腹泻病毒jiaozuo1012/2019 株的分离鉴定及遗传进化分析

2020-11-10王晓斐王玲彩杭柏林孙亚伟胡建和徐彦召

中国预防兽医学报 2020年9期

王晓斐，王青，王玲彩，杭柏林，孙亚伟，王磊，胡建和，徐彦召

（河南科技学院，河南新乡 453003）

河南省地处中原地区，2017 年生猪出栏量达到6 220 万头，成为中国第一养猪大省。除了2018 年席卷全国的非洲猪瘟，河南猪群中还存在相对严重的猪病毒性传染病，尤其是仔猪的消化系统疾病是导致仔猪大量死亡的主要原因[1]。这些危害仔猪胃肠道健康的主要疾病有：以猪流行性腹泻（PED）、猪传染性胃肠炎（TGE）、猪轮状病毒病（PoR）、猪细环病毒病等为代表的病毒性疾病，以大肠杆菌病、沙门氏菌病、魏氏梭菌、猪痢疾等为代表的细菌性疾病，以及以弓形体病和球虫病等为代表的寄生虫病。在这些疾病中以猪流行性腹泻为代表的病毒性疾病是导致仔猪病情快速、群发、难控的主要疾病[2-4]。因此，在某种程度上，控制好仔猪的腹泻性疾病是决定猪场出栏数的关键指标。

猪病毒性流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、TGEV、PoRV 以及猪细小病毒等引起猪的一种高度接触性肠道病毒性传染病。尽管目前针对部分病原已有相对应的商品化疫苗，但该病在猪群中仍有发生[5-7]。其中，PEDV 可感染各年龄段的猪，导致其出现呕吐、水样腹泻等症状，其对新生仔猪的致病率和致死率可达100%[7]。

PEDV 属于冠状病毒科冠状病毒属成员，为单股正链RNA 病毒，其基因组含有约28 000 nt，编码7 个ORF，可翻译出2 个非结构蛋白和5 个结构蛋白[8]。其中，纤突蛋白（S 蛋白）在病毒与宿主（细胞）受体结合、侵入、诱导宿主产生中和抗体以及病毒抗原和毒力变异等方面都发挥重要的生物学作用。同时，S 基因变异性较高，不同PEDV S 基因存在核苷酸的插入、删减等现象，因此S 基因常被用来分析不同时间和不同地区PEDV 流行株的亲缘关系[9]。

ORF3 蛋白由位于E 蛋白基因和S 蛋白基因之间的ORF3 基因编码。研究表明缺失ORF3 蛋白可以导致病毒在宿主体内的毒力降低或者弱化，但缺失该蛋白后并不影响病毒在体内的增殖与复制[8]。有研究者对PEDV 野毒株和致弱株的ORF3 基因序列的比对分析发现，致弱株的ORF3 基因序列中存在51 个核苷酸的缺失[10-11]。因此，对新分离株进行ORF3 基因的序列分析，可以间接分析该病毒株毒力的强弱。

本研究对2019 年2 月来自河南省焦作地区某猪场送检的临床腹泻病猪的肠道内容物样品进行RTPCR 检测，并对其中的1 份PEDV 阳性样品进行了病毒的分离鉴定，并对该分离株的S 基因和ORF3 基因进行同源性及遗传进化关系分析，为该病在河南地区的分子流行病学研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品与主要试剂 5 份病料样品采自2019年河南焦作地区某猪场腹泻仔猪肠道内容物，置于-70 ℃保存备用。PEDV N 蛋白单克隆抗体（MAb）购自Mybiosource 公司；FITC 标记的兔抗鼠IgG-FTIC购自Solarbio 公司；Hoechst33342 购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega 公司；反转录相关试剂、PCR 相关试剂、DL15000 DNA Marker、pMD19-T 载体及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa 公司。

1.2 引物设计猪病毒性腹泻相关病原PEDV、TGEV 及PoRV 的PCR 检测引物参考王康等人[12]的研究；根据GenBank 中PEDV CV777 株（AF353511）的S基因和ORF3 基因序列设计引物。引物序列如下：S-UP： ATGAAGTCTTTAACTTACTTCTGGT/S-DP：TCACTGCACGTGGACCTTTTC；ORF3-UP：ATGTTTC TTGGACTTTTTCAAT/ORF3-DP：TCATTCACTAATTG TAGCATACTC。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 腹泻样品的检测肠道内容物样品经灭菌PBS重悬后，12 000 r/min 离心5 min 后取上清液，利用试剂盒提取上清液中的总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，利用王康等人[12]报道的PEDV、TGEV及PoRV 的PCR 方法检测与仔猪腹泻相关的病毒。

1.4 病毒分离及间接免疫荧光（IFA）鉴定随机选取1 份PEDV 阳性的肠内容物样品上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，将其与胰蛋白酶混匀后接种于6 孔板中对数生长期的单层Vero 细胞，每天均观察接种细胞有无CPE 出现；无论接种细胞是否出现CPE，均收集细胞上清继续接种Vero 细胞传代培养，于接种病毒后72 h 收获培养病毒[12]。收获传代到第3 代（F3）、第5 代（F5）的细胞上清液，提取其总RNA，反转录为cDNA，利用1.2 中PEDV 的引物经PCR 检测。

分别将上述收获的F3 和F5 代的病毒上清液接种于6 孔板中新鲜培养的Vero 细胞，24 h 后弃去上清液，PBS 洗涤后，用80 %的冷乙醇，4 ℃固定细胞1 h，然后以PEDV N 蛋白MAb（1 2 000）作为一抗，以兔抗鼠IgG-FITC（1 4 000）为二抗，经Hoechst33342 细胞核染色后，对分离的病毒经IFA鉴定，并在倒置荧光显微镜下观察结果。

1.5 分离病毒的S 基因和ORF3 基因的PCR 扩增、同源性及遗传进化分析提取分离病毒感染后细胞的总RNA，反转录为cDNA，利用1.2 中的引物进行全长S 基因和ORF3 基因的PCR 扩增，PCR 产物分别克隆至pMD19-T 载体中，构建重组质粒pMD-S 和pMD-ORF3，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

利用DNAStar 和MegAlign 等软件将分离病毒的S基因和ORF3 基因与GenBank 中的已登录的PEDV 相应基因进行同源性分析；利用MEGA-X 软件构建S基因和ORF3 基因的遗传进化树，并分析该分离病毒的遗传进化特点。

2 结果与讨论

2.1 临床样品的RT-PCR 检测结果按照文献中的引物，利用RT-PCR 方法对送检的5 份仔猪腹泻肠内容物样品进行检测。结果显示，5 份样品的PEDV 检测结果均为阳性（从样品中均扩增出预期大小约为700 bp PEDV 基因片段）；而TGEV 和PoRV 的检测结果均为阴性（图略）。表明，引起该猪场仔猪发生腹泻的病原主要是PEDV。

2.2 病毒的分离及IFA 鉴定结果随机选取1 份感染PEDV 的猪肠道内容物样品处理后的上清液接种单层Vero 细胞中盲传至第3 代时（每个代次培养约72 h）可见感染细胞出现细胞融合而产生核胞体的CPE（图略）。收获细胞上清液即为F3 代病毒，继续对分离的病毒传代至F5 代收获细胞上清液，提取F3 代、F5 代细胞上清液中的总RNA，反转录为cD⁃NA，利用1.2 中PEDV 的引物经PCR 检测。结果显示，F3 代、F5 代的细胞上清液中均能扩增出PEDV特异性核酸条带。

利用PEDV 特异性MAb 对分离病毒的F3 和F5 代进行IFA 鉴定。在倒置荧光显微镜下可见，感染两个代次PEDV 后的Vero 细胞均出现特异性的绿色荧光（图1）。进一步表明分离的病毒为PEDV，将其命名为jiaozuo1012/2019 株。

图1 分离病毒的IFA 鉴定结果Fig. 1 IFA detection of isolated PEDV

2.3 分离病毒S 基因和ORF3 基因的PCR 扩增结果利用1.2 中引物对分离的PEDV 进行S 基因和ORF3基因的PCR 扩增。结果显示，分别扩增出大小约4 000 bp、600 bp 的目的基因，均与预期的S 基因和ORF3 基因大小一致（图2）；测序结果显示，分离的PEDV S基因全长为4 161 bp，ORF3基因全长为675 bp。表明，正确克隆了PEDV分离株的S基因和ORF3基因。

图2 分离病毒的S 和ORF3 基因的RT-PCR 扩增结果Fig. 2 Amplification results of S and ORF3 gene by RT-PCR

2.4 分离病毒S 基因和ORF 基因同源性及其遗传进化分析结果 S 基因的同源性分析结果显示，PEDV 分离株与国内外参考株的同源性为92.9%～99.3%。其中，与2015 年河南省分离的CH/HNLH/2015 株的同源性最高，为99.3%；与近年来河南分离株CH/HNYF/14、CH/HNZZ47/2016、CH/HNAY/2015 S基因的同源性分别为96.4%、98.4%和99.0%；与经典株CV777 的同源性较低，为93.4%。利用DNAStar软件分析该分离病毒的S 基因共编码1 386 个氨基酸。S 基因编码的氨基酸序列分析结果显示，与CV777 株相比，jiaozuo1012/2019 株在aa59～aa62 连续性插入4 个氨基酸（59QGVN62）；在aa140 和aa163～aa164分别存在1个和2个氨基酸的缺失（140N和163NI164）。S 基因的进化树结果显示，分离株jiaozuo1012/2019与目前河南省广泛流行的PEDV 亲缘关系最近，同处于一个分支（图3A）。

ORF3 基因序列的同源性分析结果显示，分离的PEDV 与国内外参考株的同源性为92.8%～99.7%。其中，与2016 年江苏省分离的JSCZ/1601 株的同源性最高，为99.7%；与近年来河南分离株的同源性为98.5%～99.6%；与经典株CV777 的同源性较低，为96.6%。利用DNAStar 软件分析该分离病毒的ORF3 基因共编码224 个氨基酸。ORF3 基因的进化树结果显示，分离株jiaozuo1012/2019 与2015 年以来国内流行的PEDV 亲缘关系最近，同处于一个分支（图3B），与S 基因的进化树分析结果一致。

分离株与PEDV 经典株进化关系较远，却具有近年来国内PEDV 流行株的分子特征，表明，分离的PEDV 为一株流行株。

本研究鉴定了2019 年河南某猪场发生仔猪腹泻疫情的病原为PEDV，并利用Vero 细胞分离获得了PEDV 自然感染株（jiaozuo1012/2019）。分离株经S 基因和ORF3 基因的克隆、测序及分析，进一步证实该株PEDV 与近年来河南地区PEDV 流行株突变特征一致，为PEDV 新的流行株[13]。本研究结果为深入探究PEDV 新流行株的致病性和致病机理奠定了基础。