表达禽β-防御素6 重组乳酸菌的构建及其免疫调节活性检测

王婷婷，王志浩，米洁兰，王文骞，高玉龙，刘长军，祁小乐，张艳萍，李 凯，高 立，潘 青，王笑梅，崔红玉

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

禽β-防御素6（AvBD6）是一类广泛存在于禽体内的宿主防御蛋白，属于禽β-防御素（AvBDs）的一种，该基因完整的核苷酸序列包含204 bp 开放阅读框，编码67 氨基酸，包括20 氨基酸的信号肽，5 个前体氨基酸和42 个氨基酸的成熟肽。AvBD6 是具有广谱抗菌活性的阳离子小肽[1]，除抗菌功能外，β-防御素还表现出多种免疫调节活性，是先天性免疫和适应性免疫系统的重要组成部分。AvBD 对免疫系统具有重要的调节作用[2]，β-防御素可由吞噬细胞和淋巴细胞产生，可启动、动员并增强宿主适应性免疫防御[3]。β-防御素不仅具有增强巨噬细胞活性、趋化性单核细胞、T 淋巴细胞、肥大细胞和未成熟树突细胞的吞噬作用，还能够诱导促炎细胞因子和免疫调节细胞因子的产生[4]。

在免疫调节方面，研究表明β-防御素显示出强大的免疫佐剂潜力，可以显著提高疫苗的免疫效力[5]。尽管已报道利用大肠杆菌表达系统能够表达重组AvBD[6]，但表达产物均以包涵体形式存在，而将包涵体形式的AvBD6 经过变性再复性最终形成具有生物活性的AvBD6 过程复杂[7]，且残留有种类繁多的内毒素。因此，研究开发出一种无内毒素、食品安全级、高效、简便和低成本的蛋白表达和生产方式是一个亟待解决的问题。

益生乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）被定义为当以适当的量给予宿主时会给宿主带来健康益处的微生物，并且已经证明它们在宿主中表现出各种生理功能，例如改善肠道环境，调节免疫功能和能量代谢等[8-9]。近年的研究表明，乳酸菌尤其是肠道乳酸菌是机体免疫系统的最大免疫调节信使，益生乳酸菌菌体较大，表面积大，不存在内毒素，可以粘附黏膜细胞并短暂定居黏膜表面，对黏膜免疫系统和全身免疫系统具有重要的调节作用，组成肠道菌-肠-脑免疫轴、肠-肝免疫轴和肠-肺免疫轴等。此外，LAB 细胞壁和核酸等成分本身就具有一定的免疫佐剂活性，重组乳酸菌作为表达和递送治疗性和预防性外源药物的活载体，是激活免疫应答的理想制剂[7]。本研究采用食品级乳酸菌表达载体，构建了表达AvBD6 的重组乳酸菌，并检测了重组乳酸菌表达的重组禽防御素的免疫调节活性，为食品安全级疫苗佐剂或免疫增强剂的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 乳酸菌表达骨架质粒pPG612和乳酸乳球菌NZ3900 感受态细胞、鸡巨噬细胞系、J774-DualTM报告细胞系等由本实验室保存； SPF 鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，抗凝血采自6 周龄～7 周龄SPF 鸡。

1.2 主要试剂 Primer STAR Max DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker 购自TaKaRa 公司；蛋白Marker购自Thermo Fisher 公司；HA 单克隆抗体（MAb）购自Biodragon 公司；山羊抗鼠IgG-HRP 购自北京全式金生物技术有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自Axy⁃gen；One Step Cloning Kit 购自Vazyme 公司；鸡外周血单个核细胞分离液购自天津TBD 公司；检测IL-10、IL-12p70 的SYBY Green Ⅰ荧光定量PCR 试剂盒购自Roche 公司；检测IL-10、IL-2、IFN-γ 的ELISA 试剂盒购自Solarbio 公司。

1.3 目的基因AvBD6 的优化及合成 根据GenBank AvBD6 的参考序列（NM_001001193.1），去掉AvBD6分泌信号肽序列，利用编码（G4S）3的蛋白Linker 基因序列（GGTGGCGGCGGATCT）将AvBD6 串联起来，拼接成为AvBD6（G4S）3AvBD6（G4S）3AvBD6（G4S）3AvBD6（4×AvBD6）基因序列，由Genescript 公司根据乳酸菌密码子偏嗜性进行基因优化并合成。

1.4 引物的合成及优化 根据优化合成后的4×AvBD6 序列，设计扩增4×AvBD6 的引物4×AvBD6-F/R（注：单横线部分为同源臂，双横线部分为HA 标签）；设计载体pPG612 的扩增引物pPG612-F/R；根据构建后的重组质粒设计测序引物tAvBD6-F/R；设计SYBY Green Ⅰ荧光定量PCR 检测IL-10 mRNA 转录水平的引物IL-10-F/R 及检测IL-12p70 mRNA 转录水平的引物IL-12p70-F/R（表1）。所有引物均由库美科技生物有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 重组质粒pPG612-AvBD6HA的构建及鉴定 以4×AvBD6 为模板，4×AvBD6-F/R 为引物PCR 扩增594 bp的带有同源臂的AvBD6序列全长（AvBD6HA），扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段。以pPG612 为模板，pPG612F/R 为引物，扩增5 050 bp的pPG612 全长序列，扩增产物经DNA 凝胶回收试剂盒回收后按照One Step Cloning Kit 说明与AvBD6HA序列进行同源重组，构建重组表达质粒pPG612-AvBD6HA。采用电转化方法将重组质粒电转至乳酸乳球菌NZ3900 感受态细胞中，构建重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900。取重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 的培养物为模板，设置阴性对照（乳酸乳球菌NZ3900）和空白对照，利用引物tAvBD6-F/R PCR鉴定并由库美科技生物有限公司测序。

1.6 重组蛋白AvBD6（rAvBD6）的表达与鉴定 将重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 及阴性对照菌株（乳酸乳球菌NZ3900）培养至OD600nm=0.4～0.5 时，加入终浓度为50 ng/mL 的Nisin，30 ℃静止诱导培养6 h～7 h，5 000 r/min 离心10 min 分离菌体和培养上清。利用PBS 稀释菌体OD600nm值（光密度）为2 后超声破碎，12000 r/min，离心10 min，上清经0.45 μm 滤器过滤后保存于-80 ℃备用。以HA MAb（1 5 000）为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1 10 000）为二抗，经western blot 鉴定上清液中rAvBD6 的表达，并利用BCA 法对重组蛋白进行绝对定量。

1.7 rAvBD6刺激鸡外周血单个核细胞（PBMCs）细胞因子的检测 采集6周龄～11周龄SPF鸡抗凝血，分离出外周血单个核细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种于1 mL/孔到24 孔板细胞培养板，在细胞培养板孔中加入50 μL 上述制备的rAvBD6，设置阴性对照[加入50 μL 的乳酸乳球菌NZ3900 的菌体裂解上清（wt-lactis-control）]，阳性对照[分别加入10 μL 浓度为1 μg/mL 的LPS（LPS）或20 μL 浓度为100 μg/mL的ConA 和浓度为1 μg/mL 的PMA 混合溶液（ConA+PMA）]，每组样品设置3 个重复。将细胞于37 ℃5% CO2培养24 h 后，提取细胞核酸，分别以L-12p70-F/R，IL-10-F/R 为引物，采用SYBY Green Ⅰ荧光定量试剂盒定量检测培养细胞中IL-12p70 和IL-10 mRNA 的转录水平[9]。

1.8 rAvBD6刺激鸡巨噬细胞系（HD11）细胞因子的检测 将鸡巨噬细胞于24 孔板中培养至1×106个/mL，在细胞培养板孔中加入50 μL rAvBD6，参照1.7 方法设置阳性对照和阴性对照，每组样品设置3 个重复。将细胞于37 ℃5% CO2培养24 h 后，提取细胞核酸，分别以IL-12p70-F/R，IL-10-F/R 为引物采用SYBY GreenⅠ荧光定量PCR 试剂盒定量检测细胞中IL-12p70 和IL-10 的mRNA 的转 录水平。

1.9 rAvBD6 激活报告细胞系J774-DualTMIRF 信号通路的检测 J774-DualTM细胞是由小鼠J774a.1 巨噬细胞系通过稳定整合诱导型报告基因（Lucia 萤光素酶基因）于IRF 干扰素信号通路激活元件中衍生而来的IRF 信号通路激活报告细胞系。该萤光素酶报告基因在ISG54 启动子的控制下，与5 个IFN 刺激的响应元件结合在一起，该基因编码的萤光素酶分泌于J774-DualTM细胞上清[10]。本试验将96 孔板中的J774-DualtmTM细胞培养至2.8×105个/mL，在细胞培养板孔中加入20 μL rAvBD6，参照1.7 设置阴性对照和阳性对照，每组样品设置3个重复。将细胞于37 ℃5%CO2培养24 h，并收取培养上清，利用微孔板化学发光检测仪（LB 960）检测培养上清中荧光素酶活性。

1.10 动物实验验证rAvBD6 的免疫增强剂活性将10日龄SPF鸡随机分为3组，分别设实验组（rAvBD6 100 μL）、PBS 对照组（PBS 100 μL，control），空菌对照组（野生乳酸乳球菌NZ3900 的裂解上清100 μL，wt-lactis-control），分别经肌肉注射免疫后两周采血分离血清，利用ELISA 试剂盒检测血清中IL-10、IFN-γ 和IL-2 的含量。

1.11 统计分析 试验数据采用GraphPad Prism 进行单因素方差分析，其结果以“平均值±标准误”表示，p<0.001为差异极显著，p<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 的鉴定 以构建的重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900细菌培养液为模板，利用引物tAvBD6-F/R 进行PCR鉴定，结果显示，扩增片段大小与预期相符，阴性对照无目的条带（图1），经测序鉴定序列正确。表明，正确构建了重组质粒pPG612-AvBD6HA和重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900。

图1 重组乳酸菌的PCR 鉴定结果Fig. 1 Amplification of AvBD6HA fusion gene by PCR

2.2 rAvBD6 的鉴定和定量 重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 经Nisin 诱 导后，western blot 鉴定 结果显示，rAvBD6 大小约为21 ku，与预期相符，阴性对照无条带（图2）。BSA 法定量结果显示，rAvBD6 含量为33 μg/mL。表明AvBD6 在重组乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 中得到了表达。

图2 rAvBD6 融合蛋白表达的western blot 鉴定结果Fig. 2 Identification of rAvBD6 fusion protein expression by western blot

2.3 rAvBD6 刺激鸡外周血单个核细胞产生细胞因子的检测 利用rAvBD6 刺激鸡外周血单个核细胞24 h，采用SYBY Green Ⅰ荧光定量PCR 对细胞中IL-10 和IL-12p70的mRNA 的转录水平进行定量分析。结果显示：rAvBD6 刺激外周血单个核细胞24 h 后，与阳性对照组和阴性对照组相比产生了高水平的IL-10[mRNA转录水平为76.01，差异极显著（p<0.0001）（图3A）]和较高水平的IL-12p70[mRNA 转录水平为120.26，差异显著（p<0.05）（图3B）]，但IL-10/IL-12p70的比值rAvBD6组与对照组相比差异不显著（图3C），表明rAvBD6可以有效激活鸡外周血单个核细胞，既能上调IL-10 的表达进行免疫负调控，又能上调12p70 的表达进行免疫激活，表明rAvBD6 刺激鸡外周血单个核细胞可以激活免疫应答，又能维持免疫稳态。

图3 rAvBD6 刺激PBMCs 后细胞因子mRNA 转录水平的检测结果Fig. 3 Detection of the transcription levels of cytokines in PBMCs upon rAvBD6 stimulation

2.4 rAvBD6 刺激鸡巨噬细胞系细胞因子的检测rAvBD6 刺激鸡巨噬细胞24 h ，采用荧光定量PCR对细胞中IL-10 和IL-12p70 的mRNA 的转录水平定量分析结果显示，rAvBD6可以刺激鸡巨噬细胞产生较高水平IL-10（mRNA 转录水平为6.62）、IL-12p70（mRNA 转录水平为2.28），并且与阳性对照组差异显著（*：p<0.05）（图4A、4B）；rAvBD6刺激鸡巨噬细胞IL-10/IL-12p70的比值与阳性对照组和阴性对照组相比差异显著（p<0.05）（图4C）。表明rAvBD6 对鸡巨噬细胞同时具有免疫激活和免疫调节双重活性。

图4 rAvBD6 刺激HD11 细胞后细胞因子mRNA 转录水平检测结果Fig. 4 Detection of the transcription levels of cytokines inHD11 cells upon rAvBD6 stimulation

2.5 rAvBD6 激活报告细胞系J774-DualTM细胞干扰素调节信号通路的检测 通过rAvBD6 刺激J774-DualTM细胞24 h，结果显示：rAvBD6 显著激活报告细胞系J774-DualTM的IRF 信号通路（相对光子数为19619RLUs），并且与阳性对照组相比差异显著（p<0.05）（图5）。结果表明rAvBD6 可以显著激活巨噬细胞的IRF信号通路，进一步激活干扰素信号通路。

图5 rAvBD6 刺激J774-DualTM细胞激活IRF 信号通路Fig. 5 Recombinant protein rAvBD6 activates IRF signaling pathway in J774-DualTM cells

2.6 动物实验验证rAvBD6 的免疫增强剂活性 免疫SPF 鸡2 周后，ELISA 检测鸡血清中IFN-γ、IL-10 和IL-2 的含量。结果显示：注射rAvBD6 两周后鸡血清中IFN-γ（mRNA 表达水平为42.36）、IL-10（mRNA 表达水平为8.28）和IL-2（mRNA 表达水平为58.72）的含量均显著高于空白对照组和空菌对照组（p<0.05）（图6）。结果表明，注射rAvBD6 可以有效激活SPF 鸡机体的抗感染免疫应答（产生较高水平的IFN-γ 和IL-2，图6B、6C），激活免疫应答的同时又可以调节免疫应答的平衡（同时产生较高水平的IL-10，图6A）。

图6 免疫两周后鸡血清中细胞因子表达量的检测结果Fig. 6 Cytokine expression levels in serum after two weeks of immunization

3 讨 论

生物安全和绿色食品安全对未来生物制剂尤其是预防性生物制剂提出了更高的要求，新型的疫苗、免疫佐剂和免疫增强剂等生物制剂也必须逐步符合绿色食品安全的基本要求。本研究制备了表达重组AvBD 的重组乳酸菌，采用了公认的食品级安全级表达菌株（食品级乳酸乳球菌NZ3900 株）和食品级Nisin 诱导表达系统，重组蛋白β-防御素6 也是天然AvBD6，并非人工设计的非天然蛋白，从表达系统到目的蛋白均完全符合绿色食品级安全的要求。AvBD6 是主要存在于天然黏膜系统的天然抗菌肽之一，是一种小的阳离子非糖基化的多肽（更适合于原核表达，无需糖基化），仅存于禽类中，主要分布于气管、肠道等黏膜组织发挥抗感染作用，不仅具有广谱的抗菌活性，还有广泛的免疫调节活性，尤其是在天然免疫和适应性免疫调节方面起重要作用[10]。并且本研究采用的食品级乳酸乳球菌NZ3900株的细胞壁成份以及其核酸均具有一定的天然免疫佐剂活性。因此，在食品安全和生物安全形势十分严峻的今天，构建安全和与益生功能相适应的免疫佐剂和免疫增强剂的表达系统具有重要意义。

本研究表达的rAvBD6 在体内外均可诱导较高水平的IL-12、IL-2 和IFN-γ，同时又可诱导产生较高水平的IL-10。其中IL-12、IL-2 和IFN-γ 属于典型的Th1 型细胞因子，主要功能是促进免疫应答，促进T、B、NK 和巨噬细胞的发育和分化，同时抑制免疫调节细胞（Treg，主要是免疫负调控T细胞）发育和抑制免疫抑制性细胞因子的产生和释放；而IL-10是典型的Treg 型细胞因子，主要功能是抑制Th1 型免疫应答，抑制炎性细胞因子的产生和释放，起到免疫负调节作用[11]，并且现代免疫学表明，IL-10 的生物学作用具有惊人的多面性和两面性，IL-10 抑制性作用的靶细胞包括胸腺细胞，T 细胞，B 细胞，NK 细胞，单核细胞，巨噬细胞，肥大细胞，中性粒和嗜酸性细胞[12]。而最新的研究结果表明，IL-10 主要影响单核巨噬细胞：抑制释放炎症介质，抑制IL-12 的合成，阻碍Th1 免疫反应，因此抑制LPS 和IFN-γ导致的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF 和GMCSF 分泌。因此，IL-10 在天然免疫中是十分重要的调节性细胞因子。但是，IL-10 可以增强单核巨噬细胞的吞噬作用，它能增加各种受体表达，这些受体能够与调理素或非调理素结合的病原微生物相结合并摄入细胞，IL-10 刺激的单核细胞还能够增强IgG-Fc 受体表达（CD64、CD32、CD16），并且CD14样分子的表达也会增加，这些分子在细胞摄取非调理素结合物质中有重要的作用[13-14]。并且，IL-10 同时具有免疫刺激作用，研究发现，它又能增强抗炎性因子释放，如增强IL-1 受体拮抗剂和溶解性TNF-α 受体的释放；IL-10 还能够在体外提高小鼠脾脏来源B 细胞的存活率，促进B 细胞表面MHCⅡ类分子的表达，促进已激活的B 细胞增殖并分化成为浆细胞，促进IgG1 和IgG3 的类别转换[14]。相关机制分析发现，IL-10 的这种作用很可能由DC 或巨噬细胞介导，通过促进表达CXCL-13 及SLAM 来招募、激活B 细胞[14]。因此，IL-10 是抗炎因子，又是免疫应答的重要调节剂。本研究结果显示，rAvBD6 可以同时诱导鸡外周血单个核细胞中促炎性细胞因子IL-12、IFN-γ 和抗炎性细胞因子IL-10 的表达；同时诱导鸡巨噬细胞中促炎性细胞因子IL-12 和抗炎性细胞因子IL-10 的表达。巨噬细胞是调节免疫应答的主要免疫细胞，研究者可以从外周血单个核细胞中分离单核细胞，诱导成巨噬细胞进行相关研究[15]。本研究动物实验中也发现注射rAvBD6 两周后可同时激活SPF 鸡诱导其产生高水平的IL-10、IL-2 和IFN-γ。说明rAvBD6 可激活机体免疫应答的同时又能维持免疫调节稳态，这与现代免疫调节的理念和最新研究结果相一致。本研究验证了rAvBD6 作为免疫增强剂的潜力，rAvBD6 即可提高免疫应答，又可维持免疫稳态，因此为天然免疫增强剂的开发和利用奠定了基础。

免疫增强剂是单独使用就可激活免疫系统和提高免疫应答能力，是增强机体特异性和非特异性免疫功能的制剂；而免疫佐剂是必须与抗原结合使用，才可提高抗原的免疫应答水平的制剂。本研究制备的rAvBD6 单独使用可激活机体诱导产生较高水平的IL-10、IL-2 和IFN-γ，并且验证了其在体内外的免疫调节活性的一致性，即激活免疫应答的同时又能维持免疫稳态。因此，本研究表达的rAvBD6 有望成为一种新型的、有潜力的天然免疫佐剂或免疫增强剂。本研究为重组禽防御素作为疫苗佐剂和免疫增强剂的研究提供了实验依据，对新型免疫佐剂或免疫增强剂的开发具有重大意义。