CD73通过AMPK/mTOR信号通路调控脊髓损伤机制研究①

邵明昊 靳明明 周 萍 郑超君 朱 巍 马晓生 吕飞舟

(复旦大学附属华山医院脊柱外科，上海 200040)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重功能障碍。全世界约有250万人患有SCI，且以每年约130 000例的速度增加[1]。SCI的病理过程分为原发性和继发性损伤2个阶段，而SCI后的继发性损伤阶段已被证明是关键的治疗时期，此期间可以实施神经保护治疗以阻止神经进一步坏死、促进功能恢复。现有证据表明多种代谢因子在SCI继发性损伤的发病机制中具有重要作用[2]。

腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是能量代谢的主要传感器，通过与ATP、ADP、AMP等结合，在能量水平下降的反应中发挥重要作用。与ATP结合时，AMPK活性被抑制，在能量释放期间，细胞内AMP水平升高，导致AMPK活化，并增加细胞分解代谢能力，产生更多ATP。作为调节因子，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在细胞内营养和生长因子丰富时被激活[3]。

外5′-核苷酸酶(CD73)是一种大小约为70 kD的糖基化蛋白，位于外质膜上，其功能是将AMP水解为腺苷和磷酸盐[2，4，5]。超过85%的小鼠AMP在CD73的作用下迅速降解为腺苷，最终使细胞内cAMP积累，同时抑制局部免疫反应，因此认为CD73与炎症相关的脑发育疾病密切相关[1，6-8]。此前，课题组确定了CD73在神经保护作用中的内在作用，这种作用是通过介导巨噬细胞/小胶质细胞极化发生的[9-12]。本研究旨在探讨CD73对脊髓损伤后AMPK的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 C57BL/6 CD73基因敲除(KO)雄性小鼠由美国俄克拉何马州医学研究基金会汤普森教授惠赠，野生型(WT)雄性C57BL/6小鼠购自上海SLAC实验动物有限公司。所有实验程序均经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准并按照其指导方针执行。

1.1.2主要试剂与仪器 TruSeq链mRNA-LT样品制备试剂盒(Illumina，San Diego，California，USA)；三唑试剂(Invitrogen，San Diego，CA，USA)；ImProm llTM逆转录酶(Promega，Madison，WI，USA)二级抗体(Jackson Immunology Research，West Grove，PA，USA)；倒置显微镜(Ti2，尼康，日本)；凝胶成像系统(UVP LLC，Upland，CA，USA)；凝胶Pro分析仪软件(Media controlnetics，Rockville，MD，USA)

1.2方法

1.2.1SCI小鼠建模 咬骨钳切除小鼠T8～T9椎板，保护硬膜完整，Dumont型镊子(尖部直径为0.2 mm)造成脊髓压迫，脊髓背侧压迫面积为0.2 mm，持续20 s。术后分别饲养，人工排空膀胱，2次/d。 对照组小鼠接受假手术椎板切除术，但脊髓无损伤。

1.2.2qPCR检测 取小鼠脊髓，TRIzol法提取脊髓损伤组织总RNA并确定总RNA的纯度和浓度，使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，取适量cDNA配置PCR 反应体系， 以 GAPDH 为内参。实验重复3次，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.3RNA测序 使用TruSeq链mRNA-LT样品制备试剂盒对WT和KO小鼠脊髓组织中RNA进行Illumina RNA测序。Illumina HiSeq 2500对RNA序列库测序，设置2×50 bp，各样本读数为7×107～1×108。随后对RNA序列数据中的KEGG进行综合分析。

使用三唑试剂从不同治疗组小鼠脊髓组织中提取总RNA，经ImProm llTM逆转录酶反转录为cDNA。SYBR试剂对mRNA进行定量分析。以GAPDH为内参。数据分析采用2-ΔΔCt法。

1.2.4免疫组化和免疫荧光测定 术后第3天提取脊髓组织样本，将部分样品浸泡在1%牛血清白蛋白和0.3%Triton X-100中1 h以阻止非特异性反应。分别以抗CD73、抗Neun、抗IL-1β、抗TNF-α、抗Caspase-3抗体4℃孵育过夜。PBS清洗后用相应的二抗室温孵育2 h，Dy488和Dy594结合二抗(1∶1 000)，以进行免疫组化和免疫荧光评估。成像使用倒置显微镜，组织切片分别行HE、Nissl、IHC和TUNEL染色。

1.2.5Western blot分析 用RIPA缓冲液提取不同治疗组小鼠脊髓组织总蛋白，BCA法分析其浓度。采用SDS-PAGE分离蛋白样品，然后将其转移至硝化纤维素膜。5%脱脂牛奶在TBST中孵育 1 h，以阻止非特异性反应。4℃下将膜与抗体(1∶1 000)孵育过夜。在室温下将HRP结合的二抗添加到膜中孵育1 h，并用电化学发光法使膜可见。使用凝胶成像系统对结果进行成像分析，凝胶Pro分析仪软件对结果进行测量。

1.3统计学分析 使用GraphPad Prism 5.02软件对结果进行统计学分析。两组间差异采用配对t检验，Pearson相关检验用于确定两组间相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SCI组织中炎症和凋亡相关因子增加 qPCR结果表明，脊髓损伤后炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和Caspase-3表达提高(图1)。HE和Nissl染色结果表明脊髓损伤后神经细胞紊乱、肿胀和尼氏体减少更为明显(图2A、B)。IHC也证实，与正常对照组相比，SCI组小鼠IL-1β、TNF-α和Caspase-3表达上调(图2C)。

图1 SCI小鼠中炎症因子和凋亡相关因子表达Fig.1 Expressions of inflammatory and apoptosis-related factors in SCI ratsNote:Compared with Sham group,***.P<0.001.

图2 SCI小鼠中脊髓组织损伤情况(×400)Fig.2 Spinal cord tissue damage in SCI rats(×400)Note:A.HE staining；B.Nissl staining；C.IHC staining.

2.2CD73缺失导致脊髓组织损伤加重 SCI后脊髓组织中CD73的表达在mRNA和蛋白质水平上均上调(图3)。TUNEL染色结果表明，与野生型小鼠相比，SCI后CD73-KO小鼠脊髓组织神经元凋亡增加(图4)。

图3 CD73对SCI的影响Fig.3 Effect of CD73 on SCINote:Compared with Sham group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

图4 KO和WT小鼠SCI 7 d后TUNEL染色结果Fig.4 Result of TUNEL staining of KO and WT mice after 7 d of SCI

2.3SCI引起CD73-KO和WT小鼠代谢改变 WT和CD73 KO小鼠的RNA测序结果显示，WT和假手术动物间存在1 649个mRNAs差异表达，与CD73 KO小鼠间有94个mRNAs差异表达。主要改变途径包括炎症反应、细胞对机械刺激的反应、铁离子稳态、凋亡和AMPK途径，其中mTOR途径的下游靶点4Ebp1差异显著，而AMPK途径也被显著激活。表明小鼠SCI后发生了代谢改变，CD73的敲除与以上代谢改变有关。

2.4CD73 KO小鼠AMPK的激活与细胞凋亡有关 与假手术组相比，CD73 KO小鼠的p-AMPK和p-ACC表达升高(图5)，表明SCI后AMPK通路的激活与p-mTOR和4Ebp1低表达相关。提示SCI通过AMPK/mTOR途径介导细胞凋亡，损伤神经元活性。

图5 Western blot检测p-AMPK、p-ACC、p-mTOR和4Epb1表达Fig.5 Expressions of p-AMPK,p-ACC,p-mTOR and 4Epb1 detected by Western blot

3 讨论

SCI或外伤性脑损伤常导致神经病理状态和随之而来的功能恢复[10]。细胞凋亡是一种细胞系统内在的基因调控反应，维持正常条件下细胞稳态[8，13]。神经元凋亡是加重SCI的原因之一，既往研究表明，细胞因子的积累能够激活星形胶质细胞，最终导致神经元凋亡[11,12]。本研究中，TNF-α、IL-1β、IL-6均在SCI组织中明显增加，可引起严重的免疫反应；进一步研究结果显示，Caspase-3和PARP在SCI小鼠中表达升高，说明SCI小鼠的脊髓组织内细胞凋亡情况更加严重。TUNEL结果显示，细胞凋亡多发生于神经元细胞，且KO小鼠中细胞凋亡更加严重。为课题组进一步探究CD73在抑制神经元凋亡中的具体机制提供思路。

已有研究表明AMPK与AMP密切相关。在动物体内，AMPK的活性主要受细胞内AMP/ATP比值调节。体内多种条件，如缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饥饿、电刺激和热休克，以及一氧化氮、三羧酸循环和氧化磷酸化的抑制剂，包括亚砷酸、抗霉素A、二硝基苯酚和叠氮化合物都可导致AMP/ATP比值上升，引发AMPK磷酸化[14，15]。CD73是一种糖基磷脂酰肌醇蛋白，在催化AMP生成磷酸和腺苷的过程中起重要作用。CD73在神经元和胶质细胞中含量丰富，局灶性脑缺血上调CD73的胶质表达[15]。课题组前期研究发现，CD73缺陷小鼠表现出更严重的运动功能障碍，与神经炎症相关的组织遭到破坏，细胞凋亡增加。本研究观察到WT、假手术动物和CD73 KO小鼠间mRNAs的差异表达存在于炎症反应、细胞对机械刺激的反应、铁离子稳态、凋亡和AMPK途径。其中以mTOR途径的下游靶点4Ebp1差异最为显著，而AMPK途径也被显著激活。提示CD73对神经元凋亡的抑制作用可能通过AMPK途径发挥作用。

既往研究发现，AMPK/mTOR信号通路与细胞凋亡有关[10，15]。本研究发现激活AMPK可抑制mTOR磷酸化，从而诱导神经元凋亡。结果表明CD73 KO小鼠模型AMPK磷酸化水平显著升高，mTOR水平相应降低等都与细胞凋亡相关，表明CD73下调可能激活AMPK、抑制mTOR和4Ebp1信号从而增加细胞死亡。结果提示CD73/AMPK/mTOR/4EBP1通路在SCI中发挥作用，CD73的调节可能是抗凋亡的生存机制，为SCI治疗提供参考。

综上，SCI小鼠模型中，CD73能够抑制脊髓继发性损伤。下调CD73可通过调节AMPK/mTOR信号通路诱导更严重的神经元凋亡。CD73可能是SCI治疗的靶点之一。