高尿酸勃起功能障碍大鼠模型的建立

葛平玉 郭银雪 常青 吴栖岸

(贵阳中医学院第一附属医院 1泌尿外科， 贵州 贵阳 550001；2肾内科)

勃起功能障碍(ED)为阴茎无法勃起，或勃起持续时间不长的一种生理现象，无法完成满意的性生活〔1〕。预计到2025年，在世界范围内，将存在3.22亿男性受ED困扰〔2〕。通常情况下，导致ED的因素较为复杂且繁多，比如高血压、糖尿病及肾衰竭等。有研究表明：ED的出现受机体高尿酸(UA)水平的影响〔3〕，研究还指出，近几年我国高尿酸血症的发病率逐渐提高，可达13%～25%〔4〕。本文建立并评价高UA ED大鼠模型，为不同目的要求的研究提供建模参考。

1 材料与方法

1.1动物 仔细筛选120只SPF级SD雄性大鼠，生长周期8～10 w，体重180～220 g，全部从贵州医科大学购入。许可证号：SCXK(黔)2015-0001。

1.2试药 酵母干粉(厂商：广州天马化工公司，产品批号：120206-03)；阿扑吗啡(APO，厂商：美国Sigma-Aldrich公司)；UA试剂(产品批号：20160606)，尿素氮(BUN，产品批号：20160518)，肌酐(Cr，产品批号：20160606)，以上试剂厂商：南京建成生物技术有限公司；氧嗪酸钾盐(厂商：北京Solarbio公司，产品批号：20160625)；盐酸乙胺丁醇片(厂商：湖北宜昌人福药业有限责任公司，产品批号：H42022126)。

1.3仪器 16通道的生理记录仪、刺激电极：选用美国Biopac公司所制造的MP150型多导电记录仪；生化分析仪：美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)AU680全自动生化分析仪；离心机:四川蜀科仪器有限公司LG-21M型离心机；电子分析天平：南通瑞科实验仪器有限公司；手术解剖显微镜：中科院光电技术研究所(四川成都)ASQM-4型。

1.4药物配置 饲料制作：常规饲料打粉后掺入酵母粉(15 g/kg)混匀，压制成圆柱状饲料。乙胺丁醇悬液：将药片碾碎成粉末状，加入消毒蒸馏水进行溶解，确保充分混合均匀，进而得到25 ng/ml的溶液备用。氧嗪酸钾盐的制备：先将此药物碾碎成细粉末状，再添加一定量的羧甲基纤维素钠溶液，充分混匀制成氧嗪酸钾混悬液备用。

1.5动物分组与处理 仔细筛选120只SPF级的SD雄性大鼠，自由进行编号，使用上述饲料适应饲养1 w，随机进行选取分为：空白对照组、模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组。其中对后4组大鼠分别花费4 w、8 w、12 w及16 w的时间来进行造模。各模型组按酵母粉(15 g/kg)饲料喂养，乙胺丁醇悬液(250 mg/kg)灌胃，氧嗪酸钾(200 mg/kg)皮下注射造模〔5〕。

1.6UA、BUN及Cr的测定 大鼠尾静脉处取血，4 000 r/min离心15 min，得到血清。采用AMS-18型自动分析仪测定UA、BUN、Cr的含量水平。

1.7高UA ED大鼠的筛选 各组模型大鼠造模最后1 d，昏暗光照下置入观察笼中，适应环境10 min后，皮下注射APO溶液(100 μg/kg),密切观察30 min。APO(+)高尿酸血症的大鼠而言，主要特征是阴茎露出；如若不然，则为高UA ED大鼠，也就是所说的APO(-)高尿酸血症大鼠。

1.8大鼠阴茎海绵体内压(ICP)测定〔6～8〕基于35 mg/kg的标准向大鼠腹腔内注射 0.4%戊巴比妥钠，确保大鼠处于彻底麻醉状态，若大鼠角膜反射丧失，则表示麻醉效果优良。借助医学解剖显微镜，充分暴露游离颈总动脉1.5 cm，过程中务必确保不要损伤周围的迷走神经。无损伤血管夹暂时夹闭颈总动脉，做“V”字切口剪开颈总动脉，迅速置入PE50管并近心端结扎固定，肝素封管后与三通管及MP150型多导电生理记录仪连接备用。从腹部正中位置切口进入，找到前列腺后外侧盆腔神经节与阴茎海绵体神经，完全展现出阴茎海绵体组织。25G输液针注入肝素，接入三通管，迅速连接MP150型多导电生理记录仪，借助显微镜，慢慢把针头插入阴茎海绵体内，保持通畅。再将刺激电极接入阴茎海绵体的神经上，其中参数设置成15 Hz、1.2 ms，分别在2.5 V，5.0 V，7.5 V条件下依次刺激1 min，且每次刺激间隔10 min。

1.9统计学方法 采用SPSS25.0软件进行t检验、非参数秩和检验。

2 结 果

2.1各组UA、BUN及Cr含量比较 各模型组UA水平显著高于空白对照组(P<0.05)。而模型Ⅳ组BUN、Cr水平显著上升，相比于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)；对比模型Ⅲ、Ⅳ组大鼠的血尿酸水平，差异不存在统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组UA、BUN、Cr比较

2.2各组ICP/平均动脉压(MAP)比较 模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组APO(-)大鼠ICP/MAP值都呈现出显著下降态势，显著低于空白对照组(P<0.05)；模型Ⅲ、Ⅳ组APO(+)大鼠ICP/MAP值显著低于空白对照组(P<0.05)。模型Ⅳ组、Ⅲ组APO(-)、APO(+)大鼠ICP/MAP值均显著低于模型Ⅱ组(P<0.05)。见表2。

表2 各组不同电刺激下ICP/MAP比较

3 讨 论

要想构建出一个高度仿真的高UA ED分析模型，务必确保血UA的稳定及维持〔9〕。连续给予造模剂可使受试动物血UA值持续升高，并在一定时间内保持相对平稳〔10〕。本实验中，主要借助了UA前体物质，UA排泄抑制剂及UA活性抑制剂进行造模，不间断进行12 w，血UA持续升高并保持相对稳定，但继续造模至16 w时血UA继续升高不明显。另外肾损害是建立高UA ED模型过程中需考虑的重要问题〔11〕，本实验在造模16 w时血Cr明显升高，出现动物死亡，推测其死亡原因可能与肾功能损伤有关，但这也是本实验的缺陷，没有进一步解剖大鼠探究其死亡原因。当造模8 w时，APO(-) 高尿酸血症大鼠的勃起功能呈显著减弱趋势，当进行12 w时，APO(+) 高尿酸血症大鼠的勃起功能呈显著减弱趋势。因此，可以根据实验目的的要求合理选择造模时间，依据APO实验筛选模型大鼠，而不必为获取ED而做更长时间的造模，以减少动物的死亡率，降低实验成本。

当前部分学者采用APO实验进行糖尿病ED筛选，APO主要通过作用于中枢系统多巴胺受体，促进勃起，研究表明皮下注射阿扑吗啡，在无性刺激的情况下，可诱发大鼠的自发勃起〔12,13〕。除此之外，本试验发现可以将APO实验应用至高UA ED的筛选。但此法的判定标准具有相对主观性，对于动物同样的表现，不同的研究者可能会产生不同的判断。

借助电刺激动物阴茎海绵体神经，以此来刺激勃起，测量海绵体内压，能够准确直观地反映阴茎勃起功能，且为消除血压对ICP的影响，采用ICP/MAP做比较，使观察标准更客观、更准确〔14〕。对比空白对照组，造模8 w时，APO(-) 高尿酸血症大鼠ICP/MAP明显下降，且APO(-)高尿酸血症大鼠ICP/MAP下降较APO(+)大鼠更为明显，这样的结论弥补了APO实验判定标准主观性的缺陷。通常情况下，ICP是评判其勃起功能的标准之一，准确且便于重复，故应用较为广泛〔15〕。但实际操作中存在操作方法复杂，可能因术中损伤阴茎海绵体神经导致电刺激无效等情况，对实验者及实验条件要求较高。可以根据实验目的及实验条件的不同，结合考虑使用APO实验及ICP测定进行筛选、评价。

综上所述，由于直接在人体进行性功能的相关研究受到伦理等多方因素的制约，所以非常有必要构建高UA ED动物模型，以此来深入探究高UA ED的发病机制、药理作用及解决措施等内容。本实验模拟人体UA产生、代谢过程，成功建立了相对稳定的高UA大鼠模型，采用APO实验筛选高UA ED大鼠，ICP/MAP客观评价高尿酸血症大鼠勃起功能。实验结果发现造模12 w内高尿酸血症大鼠勃起功能下降与造模时间呈正相关，且APO(-)高尿酸血症大鼠勃起功能更差。