卡维地洛抑制心肌成纤维细胞增殖的作用

刘絮 张广超 韩繁同 张雅 董宁 王立英

(1北华大学医学院，吉林 吉林 132013；2吉林大学第一临床医院)

心血管疾病指因心脏及血管的病变而引发的一系列病症，包括冠心病、高血脂、高血压等，最终会引起心肌纤维化(MF)及心肌重塑。MF是临床一种常见疾病，是指由于心肌成纤维细胞(CFbs)激活后出现的过度增殖、合成和分泌过量的细胞外基质(ECM)导致心肌组织中ECM的过度积聚，多种胶原蛋白发生成分的改变及其浓度增加。主要表现各型胶原比例的失衡、胶原含量增加、结构重排，影响心脏功能，终致心力衰竭发生。MF是多种心脏疾病发展的共同结局，导致心脏收缩功能障碍、心律失常及室颤的发生，最终引起难治性心力衰竭。CFbs的组成及其分泌物的改变在心肌重塑，尤其是心肌纤维化过程中发挥重要作用〔1〕。现有研究表明，第三代β受体阻滞剂卡维地洛(Car)不仅具有良好的降低血压、抗氧化作用，还具有逆转心肌重塑的作用〔2〕。本研究应用血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导新生大乳鼠CFbs增殖模型，通过对比细胞增殖率及免疫细胞化学染色后p-蛋白激酶(PK)Cα的表达量及光密度值来探讨Car抑制MF的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1成纤维细胞增殖模型的制备

1.1.1原代培养 Wistar乳鼠，1～3日龄，无菌开胸取心脏，用预冷的D-Hank冲洗心脏2次后，将其剪成1 mm3的碎片，用胰蛋白酶(0.25%)多次消化(37℃的水浴，每次5 min)后收集上清液，1 200 r/min离心10 min，弃上清液，用含10%胎牛血清的IMDM培养基重浮细胞，并将细胞接种于100 ml无菌培养瓶里，置于37℃、5% CO2孵箱内培养传代。实验采用第2～3代细胞。

1.1.2诱导CFbs增殖 IMDM培养基(10%胎牛血清)中用AngⅡ(10-7mmol/L)诱导成纤维细胞增殖，依据需要加入不同剂量Car，培养24～48 h。

1.2细胞增殖率 用胰酶(0.25%)消化处于对数生长期的成纤维细胞2 min，吹悬浮细胞制成IMDM(10%血清)培养基细胞悬液(每孔200 μl)，接种于96孔板(1×105个/ml)，每次加药前无血清培养12 h，加药后培育48 h。弃去上层液体，每孔加入20 μl噻唑蓝(MTT)溶液(5 mg/ml)和IMDM培养基180 μl，37℃、5% CO2孵箱孵育4 h。再次弃去上层液体，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 μl，震荡10 min后在酶标仪(波长495 nm)上测其光密度(OD)值，细胞增殖率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3免疫细胞化学染色 (1)CFbs爬片：将无菌的盖玻片放置于24孔细胞培养板中，将CFbs(105/ml)铺板，各组加药前无血清培养CFbs 12 h后再加入各剂量药物，继续培养CFbs 24 h进行指标检测。(2)染色：用37℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗盖玻片(5 min×3次)，多聚甲醛固定(4%，30 min)，蒸馏水冲洗3次，每次5 min，Triton(0.3%)孵育(37℃)带有CFbs的盖玻片20 min，再用PBS清洗3次，每次5 min。严格按照免疫组化试剂说明书操作检测。二氨基联苯胺(DAB)显色液显色，置镜下观察2～3 min后用自来水冲洗玻片2次，每次3 min，再用苏木素复染30 s，酒精-盐酸溶液脱色，氨水反蓝，清水冲洗多次。梯度乙醇脱水，二甲苯洗刷玻片2次，每次3 min，树胶封片，应用Image-pro plus V5.0检测OD值并进行定性定量分析。

1.4分组及给药剂量 取对数生长细胞，随机分为对照组，模型组，Car低、中、高剂量组，模型组细胞给予AngⅡ1×10-7mol/L培养，对照组不予任何处理，Car低、中、高剂量组细胞除给予AngⅡ1×10-7mol/L培养外，分别加入Car 1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 培养，细胞培养液为10%血清IMDM。

1.5统计分析 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1Car 对 CFbs 生长形态的影响 各处理组作用CFbs 24 h后，放在倒置显微镜下观察CFbs形态变化。对照组CFbs胞体较大，胞质丰富，呈长梭形，细胞彼此连接丰富；模型组CFbs增生活跃，呈火焰状，胞体增大，生长密集；加入Car后，CFbs密度逐渐降低，细胞体积缩小，呈梭形或圆形，间隙逐渐增大，细胞间连接逐渐减少，透光度降低，见图1。

图1 AngⅡ作用24 h后CFbs放置在倒置显微镜下的形态改变(×200)

2.2Car 对 CFbs增殖的影响 模型组细胞增殖率显著高于对照组(P<0.01)，Car可抑制由AngⅡ诱导的成纤维细胞增殖(P<0.01)，见表1，成功建立CFbs增殖模型。

2.3Car 对 CFbs膜p-PKCα表达的影响 各处理因素作用CFbs 48 h后，模型组胞膜黄褐色颗粒较多且深染。Car 在 10-5～10-7mol/L可不同程度减少CFbs胞膜黄褐色颗粒数量，即p-PKCα的膜表达量减少，见图2。模型组胞膜内p-PKCα OD值对照组显著增高(P<0.01)。Car 10-5～10-7mol/L可显著降低p-PKCα 胞膜染色OD值(P<0.01)，见表1。

表1 CFbs增殖百分率及p-PKCα平均光密度值

图2 Car对CFbs的p-PKCα膜转位及表达的影响(×200)

3 讨 论

MF是指心脏组织中胶原纤维过量增殖。近年来大量研究证明高血压、心力衰竭等心血管疾病可引起心肌细胞代偿性增生，最主要的表现就是发生MF。心脏结构细胞中约2/3为非肌细胞，而非肌细胞中90%以上是成纤维细胞。成纤维细胞增殖后的直接结果是心脏结构的改变，导致心脏收缩、舒张功能减退和心肌的供血供氧的冠状动脉储备能力下降。如果心肌细胞长期处于功能的失代偿状态，容易引起患者猝死。有学者提出神经系统、内分泌系统失平衡后活化的AngⅡ、ET、ALD、热休克蛋白(HSP)70等胶原合成因素参与胶原沉积及纤维化过程〔1,2〕，阻止MF的关键就是防止胶原合成因素的激活〔3〕。在肾素-血管紧张素系统中，肝脏合成的十四肽的Ang在肾脏球旁器中颗粒细胞分泌的肾素作用下，2个异亮氨酸间的肽链断裂，生成AngⅠ，AngⅠ在血浆或组织中，尤其在肺脏循环血管内皮表面存在的血管紧张素转换酶等作用下，苯丙氨酸与组氨酸间肽链断裂，产生具有生理活性的AngⅡ(八肽)。AngⅡ及其受体的结合是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(引起心肌重塑的一个重要因素)激活的重要条件〔4〕。Car是一种临床常用的治疗原发性高血压的药物，在治疗剂量范围内，兼有α1和β受体阻滞作用，阻滞突触后膜α1受体，会引起外周血管扩张、降低外周血管阻力；非选择性阻滞β受体，抑制肾脏颗粒细胞分泌肾素，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能。Car可通过以上两个过程产生降低血压的作用。有研究表明Car也可通过阻滞β1、β2和α1受体，在改善心功能的同时，降低肾上腺素能受体自身抗体的阳性率，并通过进一步研究证实其也可降低自身抗体的滴度，所以Car也被应用于临床治疗心力衰竭〔5,6〕。心力衰竭早期，机体主要通过激活肾上腺素能系统实现功能上的代偿，可短时间内增强心肌收缩能力，并加快心率等增加心输出量，有研究表明肾上腺素系统的激活加速心脏损伤，而Car可以通过阻滞肾上腺素能受体和降低自身抗体滴度来保护心肌细胞〔7〕。

研究表明，Ca2+通道阻滞剂、AngⅡ受体阻断剂、AngⅠ转换酶抑制剂及Adr受体阻断剂等都具有抑制CFbs的增殖作用〔8〕。体内实验发现多数药物存在不良反应，限制了其临床应用〔9～15〕。本研究发现Car不仅可以治疗心力衰竭，还能够抑制MF。临床应用也证实Car副作用少，尤其对于糖尿病患者几乎不影响自身糖类和脂类代谢〔8〕，近几年Car已成为临床治疗和预防MF药物的研发热点。

PKC属于苏氨酸-丝氨酸激酶家族，现已被证实对多种心脏病理生理调控过程有关，细胞的很多功能如分化、增殖、死亡或形成肿瘤等与PKC家族密切相关〔10,12〕。通过免疫组化可以观察到PKCα主要存在于细胞质中，但p-PKCα可以转移到细胞膜内部，促发一系列细胞内的信号转导，产生诸多生物学效应：参与细胞的分化、增殖；参与细胞后期迁移〔9,11,14〕，如心脏细胞〔12〕、人类视网膜细胞等〔11〕。心肌细胞肥大过程中PKC发挥十分重要的作用，其磷酸化多种激酶的前体，包括mTor、S6K1、MAPK、ERK等。综上，推断Car可能是通过抑制p-PKCα的膜转位及表达，从而抑制CFbs增殖达到抗MF的作用。