檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300的抑制作用

2020-11-10谷可欣张天翼何泾正袁中伟范维尹立子

湖南农业大学学报（自然科学版） 2020年5期

谷可欣，张天翼，何泾正，袁中伟，范维，尹立子

谷可欣，张天翼，何泾正，袁中伟，范维，尹立子*

(四川农业大学动物医学院，四川成都 611130)

采用倍比稀释法与菌落计数法，分别测定檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant，MRSA)标准菌株USA300的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)；通过测定菌液电导率与DNA外渗量，探究檀香醇对USA300细胞膜和细胞壁的影响；通过SDS-PAGE试验，探讨檀香醇对USA300可溶性蛋白代谢的作用；采用扫描电镜和透视电镜，观察经檀香醇处理后的USA300的超微结构；采用结晶紫染色法，研究檀香醇对USA300生物被膜的影响。结果表明：檀香醇能在一定程度上抑制USA300的生长繁殖，其MIC和MBC分别为32、64 μg/mL；与对照组相比，经64 μg/mL檀香醇处理1 h后的USA300菌体电导率增加3.40%±0.54%，经64、32 μg/mL檀香醇处理6 h后的菌体细胞内的DNA质量浓度显著增加(<0.05)，经64、32、16 μg/mL檀香醇处理2、6 h后的菌体的可溶性蛋白均极显著降低(<0.01)；扫描电镜和透射电镜观察结果显示，檀香醇处理过的USA300菌体细胞膜和细胞壁变化不大，但是细胞的二分裂增殖出现明显的异常；亚抑菌浓度的檀香醇能明显抑制USA300生物被膜的形成。综上可知，檀香醇主要通过干扰细菌蛋白质代谢过程，可明显降低菌体内的可溶性蛋白质含量，进而影响细菌的生命活动，而对细胞膜和细胞壁的影响甚微。由此可见，檀香醇在新型抗MRSA药物的开发过程中具有较大的潜力。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；檀香醇；DNA外渗量；可溶性蛋白质；电导率；超微形态；生物被膜；抑菌作用

金黄色葡萄球菌()是一种常见的革兰氏阳性菌，能导致人或动物的皮肤和软组织感染、败血症和肺炎[1]。传统抗生素主要通过抑制细菌生长和杀灭细菌来防治细菌感染。临床上，由于抗生素的滥用，导致了耐药菌株的出现[2]。据报道[3]，在医院获得性感染中，金黄色葡萄球菌是最为常见的革兰氏阳性菌属致病菌。金黄色葡萄球菌具有较高的感染率和较强的致病性，其耐药性变化较快，这些特点成为临床治疗金黄色葡萄球菌的一大难题。金黄色葡萄球菌中危害最大的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant，MRSA)。自1961年发现MRSA以来，MRSA以惊人的速度在世界范围蔓延，该类菌株不仅能耐受β-内酰胺类药物，还能在一定程度上耐受四环素和红霉素等抗生素[4]，其耐药性与抗生素的应用剂量呈正相关，尚无有效遏制这一趋势的药物[5]。临床上将万古霉素作为一线抗MRSA感染的药物。由于万古霉素有较大的毒性，部分金黄色葡萄球菌出现了中度耐受甚至完全耐受万古霉素的现象[6]，万古霉素的使用受到了一定的限制。

檀香醇是一种萜类化合物，是檀香精油的主要成分之一，可在一定程度上预防细菌感染，杀灭病毒等。研究[7]显示，檀香醇还能有效抑制细菌感染、减缓细胞氧化、抑制肿瘤。笔者前期研究发现檀香醇对耐药性金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，但其作用机制尚未明确。本研究中，以MRSA标准菌株USA300为研究对象，研究檀香醇对细菌生长、细菌细胞膜和细胞壁及细菌形态变化的影响，探究其具体作用及机制，旨在为后续开发高效低毒的抗MRSA药物提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

MRSA标准菌株USA300(ATCC®BAA-1717)购自美国标准菌种库，由四川农业大学兽医药理学实验室保存。檀香醇(α-和β-同分异构体的混合物)购自成都普利斯生物有限公司，用DMSO(Sigma- Aldrich，美国)溶解，配置成40.96 mg/mL的檀香醇母液。磷酸缓冲盐粉剂(1×PBS，无钙镁，pH=7.0)购自北京万佳首化生物科技有限公司。脑心浸出液肉汤、脑心浸出液琼脂购自上海古朵生物科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2　檀香醇对USA300的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度及USA300生长曲线的测定

采用倍比稀释法测定檀香醇对USA300的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。以MIC数据为参考，从各澄清的试管中移取100 μL液体，均匀涂布于脑心浸出液琼脂上，于37 ℃恒温培养箱静置培养24 h，取少于5个菌落的平板对应的檀香醇药液质量浓度定义为最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)[8]。试验重复3次。

将USA300接种于脑心浸出液肉汤(BHI)液体培养基中，按照1∶100的体积比加入BHI液体培养基稀释菌液；置于气浴恒温振荡器中培养(37 ℃，200 r/min)，直至菌液600 nm=0.3，加入檀香醇，使其终质量浓度为0、2、4、8、16、32、64 μg/mL；置于气浴恒温振荡器中继续培养，培养至0、1、2、4、6、8、16、24 h时，于600 nm波长测定菌液的吸光度值(600 nm)，绘制生长曲线[9]。

1.3　USA300菌液电导率的测定

通过测定USA300菌液在加入了檀香醇后的电导率，分析檀香醇对USA300细胞膜通透性的影响。将培养至对数期的USA300菌液(600 nm=1.8)，以2%的接种量接种于TSB培养基，置于气浴恒温振荡器中，37 ℃、200 r/min培养16 h后，加入檀香醇药液，使其终质量浓度为16、32、64 μg/mL；于37 ℃恒温培养箱静置培养0、1、2、4、6、8 h后，分别移取5 mL菌悬液，4 500 r/min离心10 min，取上清液，用5%葡萄糖溶液稀释40倍后测定电导率[10]。用DMSO等体积替换上述试验中的檀香醇药液，其他试验条件不变，设为对照组。试验重复3次，结果取平均值。

1.4　USA300的DNA外渗量的测定

通过测定檀香醇对菌体细胞的DNA外渗量，间接分析檀香醇对USA300细胞膜通透性的影响。向培养至对数期的USA300菌液(600 nm=1.8)中加入适量PBS缓冲液洗涤，重复2次，制备成浓度为107cfu/mL的菌悬液[11]；加入檀香醇，使其终质量浓度为16、32、64 μg/mL；于37 ℃恒温培养箱中静置培养0、1、2、4、6、8 h后，4 500 r/min离心10 min，取上清液，用微量分光光度计测定DNA质量浓度[12]。用DMSO等体积替换上述试验中的檀香醇药液，其他试验条件不变，设为对照组。试验重复3次，结果取平均值。

1.5　USA300可溶性蛋白质含量的测定

参照YUAN等[13]的研究方法，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE试验，测定加入终质量浓度为16、32、64 μg/mL的檀香醇处理2、6 h后的菌体内可溶性蛋白质含量。用DMSO等体积替换上述试验中的檀香醇药液，保持其他试验条件不变，设为对照组。试验重复3次，结果取平均值。

1.6　USA300形态结构的观察

参照薛东芳[14]的研究方法，向USA300菌液(600 nm=1.8)中加入檀香醇，使其终质量浓度为64μg/mL，培养至1、10、16 h时收集菌体。菌体中加入PBS缓冲液，洗涤3次，按照透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)样品制备方法[15-16]制成电镜样品。参照文献[17]的方法，观察USA300菌体细胞的形态结构。用DMSO等体积替换上述试验中的檀香醇药液，保持其他条件不变，设为对照组。试验重复3次，取其中变化最明显的一次作为结果。

1.7　USA300生物被膜总量的测定

亚抑菌浓度为小于MIC的药物浓度[18]。通过测定经亚抑菌浓度的檀香醇作用的USA300生物被膜总量，分析亚抑菌浓度的檀香醇对USA300生物被膜形成的影响。将USA300菌株接种于BHI液体培养基，于37 ℃恒温培养箱静置培养16 h后，分别加入到含檀香醇2、4、8、16 μg/mL的BHI液体培养基中，于气浴恒温振荡器中培养(37 ℃，200 r/min)至600 nm=0.6；从各BHI液体培养基中移取10 μL菌液于96孔板中，加入含3%蔗糖的BHI培养基290 μL，加入檀香醇，使檀香醇终质量浓度仍为2、4、8、16 μg/mL，37 ℃厌氧静置培养18 h后，移取质量分数为10%的甲醛溶液100 μL至平板中，固定生物膜，室温过夜，移除甲醛溶液；加入质量分数为0.1%的结晶紫溶液100 μL，室温下染色0.5 h后，除去结晶紫溶液，加入双蒸水进行漂洗，晾干；加入质量分数为33%的乙酸200 μL至96孔板内，反复吹吸孔内液体，使生物膜在孔内均匀分布；最后，将96孔板置于酶标仪下490 nm波长测量其吸光度值(490 nm)[19]。用DMSO等体积替换上述试验中的檀香醇药液，其他试验条件不变，设为对照组。试验重复3次，结果取平均值。

1.8　数据处理

运用Prism 7.0进行数据分析；组间两两比较采用检验法。

2　结果与分析

2.1　檀香醇对USA300在BHI液体培养基中生长的影响

檀香醇对USA300的MIC与MBC分别为32、度64 μg/mL。从图1可知，USA300在檀香醇质量浓为32、64 μg/mL时，生长受到抑制；檀香醇质量浓度为16 μg/mL时，USA300生长受到一定影响；檀香醇质量浓度为2、4、8 μg/mL时，USA300的生长无明显变化。

时间/h

2.2　檀香醇对USA300菌液电导率的影响

如表1所示，整体电导率变化不明显，加入檀香醇后，细菌菌液电导率呈现出小幅度的增加，但随着培养时间的延长，差异逐渐缩小；与对照组相比，差异最大的是培养时间为1 h时，质量浓度为64 μg/mL檀香醇组的电导率增加3.40%±0.54%。可见，檀香醇对细菌细胞膜的通透性影响不明显。

表1　添加檀香醇后USA300菌液的电导率

2.3　檀香醇对USA300 DNA外渗量的影响

如表2所示，与对照组相比，64、32 μg/mL檀香醇作用于菌体6 h后，菌体细胞内的DNA质量浓度显著增加(<0.05)，分别增加(3.17±1.07)、(1.94±0.32) μg/mL。可见，檀香醇对USA300的DNA外渗量有一定影响。

表2　添加檀香醇后USA300的DNA外渗量

“*”示与对照组相比差异显著(<0.05)。

2.4　檀香醇对USA300可溶性蛋白质含量的影响

如图2所示，檀香醇对多个可溶性蛋白的代谢过程造成影响。与对照组相比，经64、32、16 μg/mL檀香醇处理2、6 h后，处理组的菌体可溶性蛋白均极显著降低(<0.01)，分别降低17.08%±0.23%、26.95%±0.15%，15.74%±0.14%、26.79%±0.18%，13.49%±0.22%、14.78%±0.17%。可见，檀香醇对USA300菌体内的可溶性蛋白的代谢过程有显著影响。

M　标准分子量蛋白；1　2 h对照组；2　2 h处理组；3　6 h对照组；4　6 h处理组。a、b、c分别示64、32、16 μg/mL檀香醇处理后的USA300可溶性蛋白的含量。

2.5　檀香醇对USA300形态结构的影响

64 μg/mL檀香醇作用于USA300 1 h后，菌体表面细胞膜无明显皱缩变形(图3-a1)；1 h对照组的细胞膜、细胞壁形状饱满，表观形态正常(图3-a2)；64 μg/mL檀香醇处理10 h后，细菌菌体细胞膜与细胞壁未呈现出明显的损伤变形现象，但菌体在进行二分裂时却出现了异常，不均等分裂替代了原先的均等分裂，分裂时物质分配出现不平衡(图3-b1)；10 h的对照组中的菌体具有较为完整的细胞结构，呈现正常的均等分裂，出现了清晰的分裂缢痕(图3-b2)；64 μg/mL檀香醇处理16 h后，菌体二分裂异常更加明显，而细胞膜结构无明显变化(图3-c1)；16 h对照组的菌体二分裂正常，细胞膜完整，具有清晰的二分裂期分裂缢痕(图3-c2)。可见，檀香醇不能对USA300的细胞膜或细胞壁结构造成明显的破坏，但可以破坏细菌的分裂繁殖。

a1　1 h檀香醇处理组；a2　1 h对照组；b1　10 h檀香醇处理组；b2　10 h对照组；c1　16 h檀香醇处理组；c2　16 h对照组。

2.6　檀香醇亚抑菌浓度对USA300生物被膜形成的影响

对照组和16、8、4、2 μg/mL檀香醇处理组的490 nm分别为1.33±0.18、0.79±0.08、0.92±0.13、0.98±0.15、0.97±0.08，对照组吸光度值极显著高于其他组的(<0.01)；经16、8、4、2 μg/mL檀香醇处理后，USA300生物被膜总量比对照组分别减少40.60%±10.25%、30.83%±7.75%、26.32%±8.12%、27.07%±10.75%。可见，檀香醇对USA300生物被膜的形成呈现出显著的抑制作用。当檀香醇质量浓度为16 μg/mL时，其抑制作用最为明显。

3　结论与讨论

本研究中，MIC、MBC的结果显示，檀香醇能明显抑制并杀灭USA300，表明檀香醇可应用于抗MRSA感染药物的开发。

细胞膜作为保障细胞内环境稳态、维持正常代谢活动的屏障结构，其被破坏后往往会给菌体的生命活动造成很大障碍[20]。本研究中，檀香醇对USA300菌液的电导率影响不明显，说明其对细菌的细胞膜的影响较小。DNA外渗量可间接地反映细胞膜、细胞壁的破损情况[21]。本研究中，64、32 μg/mL檀香醇作用于菌体6 h后，菌体细胞内的DNA质量浓度较对照组的显著增加(<0.05)，这可能是由于檀香醇在一定程度上影响了细菌细胞膜的通透性。采用扫描电镜和透射电镜对细胞形态进行观察，发现细菌的细胞膜、细胞壁无萎缩变形等明显的变化，但细菌增殖出现异常的不均等分裂，这说明檀香醇可破坏细菌二分裂的增殖，而对细菌细胞膜、细胞壁几乎没有影响。这可能是因为檀香醇干扰了细菌增殖所需要的酶或蛋白，从而导致细菌二分裂无法正常完成，其具体的作用机制还有待进一步的研究。

可溶性蛋白作为关键的营养物质，可以调节细胞渗透，增强细胞的保水能力，有效保护细胞的生物膜[22]。本研究中，经64、32、16 μg/mL檀香醇处理过的细菌菌体，可溶性蛋白总量较正常细胞极显著降低(<0.01)，这说明檀香醇能有效抑制细菌可溶性蛋白的新陈代谢，破坏细菌的生命活动。生物被膜是细菌细胞外聚合物包裹形成的聚合体，可减弱细菌对抗菌药物的敏感性[21]，是MRSA对医疗器械进行感染的主要毒力因子[23]。本研究中，亚抑菌浓度的檀香醇显著抑制MRSA生物被膜的形成，说明檀香醇可降低MRSA的黏附能力并增强MRSA对抗生素的敏感性，具有开发为抗毒力因子药物的潜能。

冬凌草甲素[13]、百里香酚[24]、松萝酸[18]等主要是通过抑制和破坏细菌的细胞膜、细胞壁来达到杀灭和抑制细菌。与上述传统中药单体相比，檀香醇能明显破坏MRSA菌体蛋白质的新陈代谢和生长繁殖，而对菌体的细胞膜、细胞壁结构影响甚微，表明在新型抗毒力因子药物开发过程中檀香醇具有较大的潜力。

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Antibacterial effect of santalol on methicillin-resistant

GU Kexin, ZHANG Tianyi, HE Jingzheng, YUAN Zhongwei, FAN Wei, YIN Lizi*

(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China)

The minimal inhibitory concentration(MIC) and minimal bactericidal concentration(MBC) of santalol to methicillin-resistant(MRSA) standard strain USA300 were determined by colony counting and broth dilution methods, respectively. The effect of santalol on USA300 cell membrane and cell wall was measured by conductivity and DNA content in liquid. The effect of santalol in the process of soluble protein metabolism of USA300 was studied by SDS-PAGE. The ultrastructure of USA300 treated with santalol was observed by scanning electron microscope and transmission electron microscope. The effect of santalol in the formation of USA300 biofilm was determined by crystal violet staining. The results showed that santalol could inhibit the growth and reproduction of USA300. The corresponding MIC and MBC were 32 and 64 μg/mL, respectively. Compared with the control group, the electrical conductivity of the bacteria treated with 64 μg/mL santalol for 1 hour increased 3.40%±0.54%; the intracellular DNA mass concentration of bacteria treated with 64 and 32 μg/mL santalol for 6 h increased significantly, while the soluble protein decreased significantly after 2 h and 6 h of treatment with 64, 32 and 16 μg/mL santalol(<0 01). The micrographs of scanning electron microscope and transmission electron microscope showed that the cell proliferation had obvious abnormality with no changes on the USA300 cell membrane and cell wall. The results showed that the formation of USA300 biofilm could be inhibited significantly by giving santalol with subinhibitory concentration. In summary, santalol could significantly reduce the soluble protein content in the bacteria by interfering with the protein metabolism process, and affecting the life activities of bacteria. Santalol has great potential in the development of new anti-MRSA drugs.

methicillin-resistant;santalol; DNA exosmosis; soluble protein; conductivity; ultrastructure; biofilm; bacteriostatic effect

S853.74

1007-1032(2020)05-0594-07

谷可欣，张天翼，何泾正，袁中伟，范维，尹立子．檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300的抑制作用[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2020，46(5)：594-600．

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http://xb.hunau.edu.cn