雌激素通过调节Nrf2/ROS信号通路诱导正常乳腺细胞生物学改变

韦任雄 陈丹丹 朱玲 张玉柱 陈前军

1广州中医药大学第二临床医学院（广州510006）；2广东省中医院乳腺外科（广州510120）

乳腺癌是女性最常见和高发的恶性肿瘤，根据最新全球的癌症统计数据［1］，其发病率和病死率在女性癌症中的占比分别为24.2%和15.0%，是女性癌症死亡的首要原因。在我国，乳腺癌也是女性癌症死亡的主要原因，并且随着人们生活方式的西化，伴随人口增长和人口老龄化，我国未来癌症负担尤其乳腺癌的负担会迅速增加［2］。因此，了解雌激素的致癌作用及机制，对乳腺癌的预防及药物开发具有重要意义。

临床流行病学调查结果显示，接受激素替代疗法［3］、早初潮、晚绝经、肥胖［4］等都将增加女性患乳腺癌的风险。雌激素通过受体介导的过程［5］或其毒性代谢物刺激细胞生长和增殖，导致乳腺的癌变［6］。体内外实验均证实雌激素对乳腺的致癌性，而抗雌激素能预防乳腺癌的发生［7-8］。核因子E2 相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）作为重要的氧化还原敏感性转录因子，其通过诱导调控细胞内Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白表达（如NQO1、HO-1、GCLM 和GCLC），有利于改善机体氧化应激状态和保护细胞功能［9］。因此，Nrf2转录因子失活，细胞氧化应激水平升高，进而导致细胞损伤甚至癌变［10-11］。本研究的目的是通过雌二醇（Estradiol，E2）诱导正常乳腺细胞生物学改变来评估其致癌作用，并探讨其相关的通路机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂人源正常乳腺上皮细胞株MCF-10A 和MCF-12A 由中山大学孙逸仙纪念医院乳腺癌研究团队惠赠。雌激素（E2758）购自Sigma公司；乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）测定试剂盒购自南京建成公司；8-羟基脱氧鸟苷（8-Hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）检测试剂盒购自CUSABIO 公司；AnnexinVFITC 凋亡检测试剂盒购自Thermo 公司；Nrf2、HO-1 抗体购自Abcam 公司，其二抗购自联科生物。

1.2 仪器CKX41 倒置荧光显微镜（Olympus）；VICTOR X5 型 酶标仪（Biotek 公司）；KQ-100DE 型数控浴式超声仪（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；1-15K冷冻台式离心机（德国Sigma公司）；流式细胞仪FACS VantageTM（美国Becton Dickinson公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT 实验将细胞以每孔5 × 103个的密度，接种于96 孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h 后，加入含不同浓度雌激素（0、0.5、1、5、10、100 nmol/L）培养基，每组设5 个复孔。继续培养24 h 后，弃旧培养基，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液和100 μL无血清DMEM/F12培养基，培养箱中孵育4 h。弃去MTT 溶液，每孔加入150 μL DMSO，摇床上避光震荡10 min。多功能酶标仪上测定吸光度（OD）值（测定波长为490 nm）。

1.3.2 荧光探针DCFH-DA 检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）将细胞以5 ×105个/孔接种到6 孔板，培养箱培养24 h 后，按分组进行给药处理。药物作用24 h 后，每孔加入1 mL 10 μmol/L 的DCFH-DA 稀释液，避光孵育20 min，每隔3～5 min 摇匀一次，用无血清培养基洗涤细胞3 次。在酶标仪488 nm 激发波长，525 nm 发射波长检测各组的荧光强弱。

1.3.3 检测8-OHdG、LDH、ROS、SOD、GPX、CAT

和TAC 水平雌激素诱导细胞后，采用ELISA 法检测细胞内8-OHdG 水平、微量酶标法检测LDH 水平、可见光法测定CAT 活性、羟胺法测定SOD 活性、比色法测定GPX 活性、微板法测定TAC 活性，按说明书进行操作。

1.3.4 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡将细胞以5 × 105个/孔接种到6 孔板，培养箱培养24 h后，按分组进行给药处理。药物作用72 h 后，用无EDTA 胰酶消化并收集细胞悬液，PBS 清洗2 次。加入400 μL 的Binding buffer 重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混匀后，再加入5 μL Propidium Iodide混匀后室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5 划痕实验将细胞以5 × 105接种在6 孔板中，待细胞融合度达100%时，用200 μL 的tip 枪头在细胞中央划痕，PBS 清洗3 次，按分组进行给药处理。于0 h 和48 h 分别在相同位置拍照，并计算划痕愈合率，划痕愈合率（%）=（0 h 划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%）

1.3.6 平板克隆实验将细胞以1 000 个/孔接种到6 孔板中，24 h 后，按分组进行给药处理。孵育2 周后取出培养板，期间每3 天更换一次培养液。用PBS 清洗3 次。4%多聚甲醛固定20 min。吸去固定液，加适量0.02%结晶紫染色液染色30 min。光学显微镜下观察实验组与对照组形成的细胞集落。

1.3.7 Western blotting将细胞以5×105个接种在6 孔板上，待细胞贴壁，加入含雌激素（0、5 nmol/L）的完全培养基培养24 h。提取细胞总蛋白，用BCA 法测定蛋白质浓度后，取35 μg 蛋白质量进行上样电泳，然后转移到0.22 μm PVDF 膜，接着封闭1 h、一抗4 ℃孵育过夜、第2 天孵二抗1 h，最后曝光显影。

1.3.8 RT-PCR将细胞以5×105个接种在6 孔板上，待细胞贴壁，加入含雌激素（0、5 nmol/L）的完全培养基培养24 h。采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）法测定。Trizol 法提取细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，全自动荧光定量PCR 仪扩增并进行荧光定量检测。设计合成引物，Nrf2引物序列：上游5′-GACGGTATGCAACAGGACATTGAG-3′，下游5′-AACTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGGA-3′扩增片段长度为120 bp。HO-1 引物序列：上游5′-ACATCGACAGCCCCACCAAGTTCAA-3′，下游5′-CTGACGAAGTGACGCCATCTGTGAG-3′，扩增片段长度为110 bp。NQO-1 引物序列：上游5′-GGATTGGACCGAGCTGGAA-3′，下游5′-AATTGCAGTGAAGATGAAGGCAAC-3′，扩增片段长度为120 bp。GAPDH 引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增片段长度为110 bp。PCR 反应条件：10 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，40 个循环，GAPDH 为内参，检测各模板的Ct 值（C 代表cycle，T 代threshold）。实验重复3 次。

1.3.9 统计学方法采用SPSS 19 系统软件进行数据分析，实验数据均用均数±标准差，采用t检验确定两组间差异的统计学意义，P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雌激素对MCF-10A 和MCF-12A 细胞增殖、DNA 氧化损伤及细胞凋亡的影响使用不同浓度的雌激素处理MCF-10A 和MCF-12A 细胞24 h，结果显示，0 ～10 nmol/L 的雌激素浓度可以促进细胞的增殖，并且5 nmol/L 为最佳促进浓度（图1A）。与空白组相比较，雌激素组中细胞的活性显著增高（图1B），同时8-OHdG 和LDH 水平明显上升（图1C、1F），即细胞毒性和DNA 氧化损伤增高，但细胞凋亡水平反而降低（图1D、1E），差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图1 雌激素对MCF-10A 和MCF-12A 细胞增殖、DNA 氧化损伤和细胞凋亡的影响Fig.1 The effects of E2 on cell proliferation，DNA oxidative damage and cell apoptosis of MCF-10A and MCF-12A cells

2.2 雌激素对MCF-10A 和MCF-12A 细胞迁移和克隆能力的影响通过划痕试验和克隆形成实验，来评估雌激素对正常乳腺细胞的致癌性。与空白组相比较，雌激素组中乳腺细胞克隆能力（图2A、2B）和迁移显著增强（图2C-E），差异均有统计学意义（P＜0.001）。

2.3 雌激素对MCF-10A和MCF-12A细胞ROS及氧化酶的影响与空白组相比较，雌激素作用后，可导致细胞内ROS 的积累，使ROS 的水平显著上升（图3A），同时雌激素组细胞内SOD、GPX、CAT和TAC 等氧化酶活性明显受到抑制（图3B-E），差异均有统计学意义（P＜0.001）。

2.4 雌激素对MCF-10A和MCF-12A细胞Nrf2及其下游蛋白的影响雌激素组Nrf2 和HO-1 蛋白低表达于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.01，图4A-C）；与空白组相比较，雌激素组细胞内Nrf2、HO-1 和NQO1mRNA 表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，图4D-F）

3 讨论

图2 雌激素对MCF-10A 和MCF-12A 细胞克隆和迁移能力的影响Fig.2 The effects of E2 on cell clone and migration of MCF-10A and MCF-12A cells

乳腺癌主要由乳腺上皮细胞产生，具有异质性，并且乳腺癌发病率呈逐年上升发展趋势［12］。在此基础上，了解乳腺癌的发病机制，寻找乳腺癌发生发展的遗传标志，对乳腺癌预防性治疗，降低发病率具有重要意义。研究［13］发现Nrf2 信号通路的活化可以促进其下游抗氧化酶NQO1、HO-1 等的表达，氧化酶通过消除活性氧等有害物质，防止DNA 的氧化损伤，预防细胞癌变。

图3 雌激素对MCF-10A 和MCF-12A 细胞ROS 和氧化酶的影响Fig.3 The effects of E2 on ROS and indicators related to Oxidase of MCF-10A and MCF-12A cells

图4 雌激素对MCF-10A 和MCF-12A 细胞Nrf2 及其下游蛋白、mRNA 表达的影响Fig.4 The effects of E2 on Nrf2 and downstream protein and mRNA expression in MCF-10A and MCF-12A cells

研究［14］证实雌激素的氧化代谢途径导致乳腺癌的发生。首先8-OHdG 作为DNA 氧化损伤的经典标志物，而DNA 损伤可导致基因突变是癌症发生过程中的关键步骤［15］。另外氧化应激是DNA 损伤的重要原因之一［16］。而氧化酶能抑制氧化应激清除产生的ROS，保护细胞免受损伤［17］。Nrf2 作为细胞氧化应激反应的关键调控因子，调控HO-1和NQO1 等氧化酶的表达［18-19］，维持氧化还原稳态，消除致癌物质。本研究结果显示，雌激素可以刺激MCF-10A 和MCF-12A 细胞增殖，并且在一定浓度范围内随浓度增加，增殖效果越明显。同时雌激素能增强正常乳腺细胞迁移和克隆能力，降低细胞凋亡水平，与YAN 等［20］的研究结果相一致。ANWESHA 等［21］通过雌激素诱导细胞后发现8-OHdG 的表达水平明显增高，确定雌激素可诱导DNA 的氧化损伤，本实验研究也有相一致的结果。研究结果进一步发现，雌激素能够促进ROS在胞内积累和抑制SOD、GPX、CAT 和TAC 等氧化酶的活性，并调控Nrf2 及其下游HO-1 和NQO1 的表达，引起氧化应激，诱导细胞DNA 的氧化损伤，使细胞发生生物学上的改变，最终向癌变转化，与SINGH 等［22-23］的研究结果也有相一致。

综上所述，本研究从氧化应激的角度，并引入近期热点研究的抗氧化基因Nrf2，发现雌激素可以调节Nrf2/ROS 通路，诱导细胞生物学表现的改变，揭示氧化应激参与乳腺癌的发病机制。本实验存在一定的局限性，细胞仅在雌激素作用下研究，雌激素代谢物以及其拮抗剂进行平行实验以保证实验可靠性；同时单纯体外研究具有片面性，后续将在动物实验模型上进一步研究，以期为乳腺癌的预防治疗提供潜在靶标。