惊扰应激状态下大黄鱼血清生化指标及肝脏抗氧化活力的变化

孙 鹏，唐保军，姜亚洲

（中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

在水产养殖过程中，鱼类常受到诸多环境因素的影响。养殖生产实践中所涉及的捕捉、排污、运输等操作都是不可避免的，这些操作环节也会对鱼类造成一定的胁迫作用，致使养殖鱼类应激反应的发生［1］。应激（stress）是生物体遭受环境刺激时出现的非特异性生理反应，是机体的一种防御机制。适当的应激源刺激有助于机体快速适应环境变化，但若超出机体自身的适应范围，则会造成机体内环境紊乱，诱发疾病或致使疾病发展、恶化［2］。养殖生产中许多难以根治的顽固性疾病往往是鱼类长期处于应激状态的结果，必须引起高度重视。近年来，养殖应激相关研究逐渐开展起来［3-6］。

大黄鱼（Larimichthys crocea）属于鲈形目（Perciformes），石首鱼科（Sciaenidae），黄鱼属，是我国近海重要的经济鱼类，也是浙江、福建、广东等东南沿海省份重要的海水网箱养殖鱼类。由于其对多种外界环境因素敏感，养殖和管理过程中引起的应激反应影响已经成为一个亟待解决的突出性问题，这也给养殖管理造成了一定的困难［1，7］。近年来，大黄鱼环境胁迫相关研究已有报道，其主要涉及水体、温度和养殖密度等［7-9］，而对于捕捉、排污、惊扰等生产过程中出现的容易被忽视的常见因素引起的胁迫应激研究相对较少［1］，关于其应激过程中鱼体的生理变化规律也知之甚少。为此，本研究通过分析人工惊扰状态下大黄鱼体内重要生理生化指标及抗氧化酶活力变化，探讨了应激状态下鱼体对应激反应的适应性响应，研究结果可为大黄鱼健康养殖生产提供信息支持，也可为鱼类胁迫应答机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验鱼为福建省宁德市富发水产有限公司人工繁育的大黄鱼成体，平均体质量为（88.91±9.27）g，挑选体色正常、无伤无病、行动迅速、生命力强的个体用于胁迫实验。实验前于室内水泥池（6.0 m×4.0 m×1.5 m）中养殖，实验用海水经过砂滤处理［盐度25.7±0.5，水温（25.6±0.5）℃］；采用连续充气，每日换水1次，换水量2/3，每日投喂颗粒饲料2次（8∶00和14∶00）。

1.2 胁迫实验和取样

实验时，将暂养的大黄鱼放入10组1 t的PVE桶中，每桶加入海水700 L，并放入试验鱼30尾。随机选择其中1组作为对照组，其余的9组作为无差别的处理组，每组内设置2个重复。并在随后的取样过程中，每次从未取过样的一组中采集样品，以避免因取样造成的密度等因素对实验测定的干扰。惊扰处理一共持续10 d，处理方法参照翁朝红等［1］，并做了部分改进。每日定时采用1 m长的PVE管（直径2 cm）快速绕桶壁驱赶试验鱼10 min，再将桶中的大黄鱼用抄网捕捉并暴露于空气中10 s。为尽量保证胁迫强度的定量，追赶速度设定为每3 s绕PVE桶旋转驱赶2圈。

分别在处理后第0、3、6、24、48、72、96、120、240小时对试验鱼进行取样。取样过程中，每次从1组PVE桶随机选取6尾大黄鱼并用MS-222进行麻醉，经静脉取血后解剖取肝脏组织，准确称重后按质量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入生理盐水，经匀浆（冰水浴）和离心（2 500 r·min-1，10 min）后取得上清液待测。对样品鱼肝脏中总蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）进行测定，每个样品重复测定3次；血液样品置于1.5 mL离心管中，4℃静置8 h后离心（3 000 r·min-1，10 min），收集上层血清用于生化指标测定。皮质醇含量采用ELISA方法测定，SOD和血糖含量采用比色法，CAT、溶菌酶和乳酸含量采用分光光度法测定，所需试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所，并参照说明书进行操作。

1.3 数据分析

所得的全部数据均表示为平均值±标准误差（Mean±SD）的形式。利用SPSS 25.0软件中的方差分析和Duncan氏检验进行多重比较，P＜0.05时被认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 应激状态下大黄鱼血清皮质醇的变化

应激状态下大黄鱼血清中的皮质醇含量变化如图1所示。在惊扰处理后，大黄鱼血清中皮质醇含量快速升高，在处理3 h后其含量开始显著高于对照组（P＜0.05），在处理6 h后达到最高峰；之后，皮质醇含量逐渐降低，虽然期间含量也高于对照水平，但与对照组并无显著性差异（P＞0.05）。

图1 应激状态下大黄鱼的皮质醇含量变化Fig.1 Changes of cortisol concentration in Larim ichthys crocea under stress

2.2 应激状态下大黄鱼血糖和乳酸含量的变化

应激状态下大黄鱼血清中的血糖含量也随着处理时间的延长出现显著变化。如图2所示，惊扰处理3 h时大黄鱼血清中血糖含量快速升高，其含量在处理后的72 h一直处于较高水平并显著高于对照组（P＜0.05）；在处理72 h后，血糖含量开始降低并恢复至惊扰处理前水平。

应激状态下大黄鱼血清中的乳酸含量也出现与血糖含量相近的变化（图3）。自处理后3 h开始，大黄鱼血清中乳酸含量快速升高，并在处理后6 h处于最高水平（P＜0.05）；高乳酸状态一直持续到惊扰处理后48 h，之后也逐渐降低并恢复至胁迫处理前水平。

图2 应激状态下大黄鱼的血糖含量变化Fig.2 Changes of glucose concentration in Larim ichthys crocea under stress

图3 应激状态下大黄鱼的乳酸含量变化Fig.3 Canges of lactic acid concentration in Larim ichthys crocea under stress

2.3 应激状态下大黄鱼肝脏抗氧化酶活力的变化

惊扰处理后，大黄鱼在应激状态下的肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性也呈现升高的趋势（图4）。在胁迫处理的第1天，肝脏中SOD酶活力随处理时间的推移而逐渐升高，并在处理后6 h达到最高峰值，这种显著性增高的趋势一直持续到处理后24 h；随后，SOD活力开始下降，最终的酶活力水平稍高于对照组，但差异并不显著（P＞0.05）。

与肝脏中SOD酶活力变化趋势不同，应激状态下大黄鱼过氧化氢酶（CAT）活力（图5）在惊扰处理后第1天并未出现显著性变化；在处理后第2天，酶活力开始逐渐升高，在处理后第3天开始显著高于对照组酶活力（P＜0.05），并在处理后第5天（120 h）达到最高值；之后，CAT活力一直保持较高的水平，且在胁迫处理的第10天仍显著高于对照组水平（P＜0.05）。

图4 应激状态下大黄鱼的超氧化物歧化酶含量变化Fig.4 Changes of SOD activity in Larim ichthys crocea under stress

图5 应激状态下大黄鱼的过氧化氢酶活力变化Fig.5 Changes of CAT activity in Larim ichthys crocea under stress

2.4 应激状态下大黄鱼溶菌酶的变化

惊扰胁迫处理后，大黄鱼溶菌酶活力变化趋势如图6所示。在惊扰处理后第1天大黄鱼血清中溶菌酶活力逐渐升高，在处理后第6小时达到最高值，并显著高于对照组水平（P＜0.05）；随后，溶菌酶活力又开始下降至对照组水平；然后，溶菌酶活力在应激反应第3天和第4天又开始升高并维持较高的水平状态（P＜0.05）；在惊扰处理的第10天，溶菌酶活力仍高于对照组水平，但差异并不显著（P＞0.05）。

图6 应激状态下大黄鱼的溶菌酶含量变化Fig.6 Changes of lysozyme concentration in Larim ichthys crocea under stress

3 讨论

鱼类属于水生低等变温脊椎动物，生存容易受到外源环境因素影响。目前，日益恶化的环境对鱼类造成的影响已成为一个突出性问题［2］。同样，在养殖生产中鱼类也常受到多种环境因素的影响，继而引发鱼体的应激反应［10-11］。应激反应可分为3级：初级应激反应是鱼类神经内分泌系统水平上的反应，主要表现为血清肾上腺素或去肾上腺素以及皮质醇含量显著升高；次级应激反应为初级反应引起的呼吸系统和免疫系统等各组织与器官方面的变化；而第三级应激反应是在次级应激反应基础上导致的如生长速率、抗病能力、繁殖能力及行为等个体以及群体方面的改变。

鱼体接收到外界胁迫信号后，首先由其下丘脑产生促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）传递给脑垂体，脑垂体前叶受到CRH刺激分泌促肾上腺皮质激素（ACTH），并传递给肾间组织，再由肾间组织产生以皮质醇为主的皮质类固醇，并释放到血液中去引发其他反应。皮质醇是参与鱼体应激反应过程的重要激素，其含量的快速升高已见于多种鱼类胁迫应激相关报道［12-13］。皮质醇通过代谢调节，可促进糖元、蛋白质和脂肪分解以应对应激反应。但皮质醇同时还具有免疫抑制和抗炎功能，应激和适应过程中血清皮质醇浓度升高往往也会导致机体免疫力下降。例如，大西洋鲑（Salmo salarLinnaeus）经过操作胁迫处理后，随着皮质醇含量的升高，免疫细胞中IL-1β等基因会出现过表达，继而降低白细胞在外界病原入侵时候的存活力［14］。本研究中，大黄鱼经惊扰胁迫处理后，皮质醇含量也快速升高，并在胁迫处理6 h时达到最高峰，这是大黄鱼经外界人工干扰后的初级应激反应；之后，随着鱼体对外界刺激的逐步适应，皮质醇含量也逐渐降低并最终恢复到处理前水平，这有利于鱼体对自身内稳态的维持，同时也体现了大黄鱼对长期应激状态的适应性调节。

血糖是血液中重要的能源物质，为鱼体进行各种生命活动所需能量的直接来源。大黄鱼在应激状态下血清中血糖含量显著增加，推测鱼体在受到外界刺激后能量消耗剧增，体内代谢加快，糖原消耗加速；同时，皮质醇含量的增加将促进肝脏糖异生作用并降低各组织对血糖的利用率，这都将导致大黄鱼血液中血糖含量快速升高，为机体应对外界环境变化提供能量。相似的情况也出现在胁迫后的银鲳（Pampus argenteus）［12-13］、大西洋鲑［14-15］等鱼类中，以保障机体可以经受住外界因素刺激，快速调节机体以适应外界环境并维持相对稳定的状态。乳酸主要在肌肉供氧不足的情况下由糖酵解产生［12］。在剧烈运动的状态下，糖酵解可迅速为机体提供能量。大黄鱼经人工追赶和空气暴露处理后，鱼群受惊并表现为呼吸急促和快速游动，这都可导致鱼体内乳酸含量的升高。

溶菌酶是一种碱性蛋白，它可通过水解革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖使之裂解并释放出来，以破坏和消除侵入体内的外源性物质。研究表明，在急性胁迫情况下溶菌酶活性可以作为鱼类应激程度的指示信号［16］。例如，在浑浊的水体中半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）肝脏内溶菌酶活性随着悬浮物浓度升高和处理时间延长而显著增加［17］。本研究也发现，大黄鱼受胁迫后溶菌酶也呈现活力升高的趋势，推测这与应激状态下鱼体的免疫防御行为有关。随着鱼体对外界刺激的响应，体内需消耗大量能量以调整和适应新的环境，鱼体的氧化损伤以及免疫相关基因的表达变化可能降低机体对外源病原菌的杀伤力。这时，为抵御和消除病原菌侵入所造成的伤害，作为先天性防御系统重要成员的溶菌酶通过增加活力以抵御外界病原的影响。然而，详细的情况尚待进一步研究。鱼类的新陈代谢活动会产生自由基（ROS），它是机体正常代谢的副产物。通常情况下，体内ROS的产生和抗氧化过程处于动态平衡中。在鱼体受到外界刺激而引发应激反应时，机体内的ROS会迅速积累。当体内的自由基含量积累到一定程度且超过机体的清除能力时，则会产生氧化应激（oxidative stress），对鱼体的脂类、蛋白质和DNA造成氧化损伤［18］。自由基导致的氧化损伤不仅能造成细胞膜损伤，还可以使多种酶功能失活，从而削弱机体的免疫能力［19-21］。SOD和CAT在清除自由基方面发挥着重要作用，对机体细胞损伤后的氧化过程和吞噬作用具有很强的防御功能［22-23］。其中，SOD被认为是率先起作用的抗氧化酶之一，是超氧阴离子自由基（O2-）的天然消除剂。本研究发现，在惊扰胁迫处理第1天，大黄鱼肝脏中SOD酶活力随着处理时间的延长而显著增加，表明SOD在大黄鱼的应激调节和适应过程中发挥着重要的抗氧化作用；之后，随着机体对外界刺激的逐渐适应和调节，SOD活力逐渐恢复至实验前的水平。SOD清除过程中产生的H2O2能在CAT的催化下生成H2O和O2，故CAT活力的整体升高趋势迟于SOD；与SOD活力变化规律不同，直至实验结束CAT含量一直显著高于对照组，表明长期的应激状态导致大黄鱼体内自由基含量一直处于较高的水平，而这必然会导致大黄鱼细胞损伤进而影响其免疫防御机能。

在日常养殖实践中，人们常认为维护操作对鱼体的影响较小，因而这些胁迫因素容易被忽视。本研究模拟了换水、清污和结网等操作过程中涉及的惊扰因素，从生理学角度分析了惊扰操作处理对大黄鱼个体的影响，探讨了大黄鱼在应激状态下的适应性响应规律。研究显示，人工惊扰操作可引起大黄鱼应激反应，其应激与适应的过程涉及神经内分泌、能量代谢、抗氧化以及免疫调节在内的多个系统的协同作用。其中涉及的生理指标如皮质醇、血糖、乳酸、SOD和CAT等均出现显著性变化，体现了它们作为应激反应的生物指示剂的潜力［24］。在应激反应前期，大黄鱼调节自身机能以应对外界环境变化，鱼体将逐渐适应新环境，而体内多个系统也逐渐趋于新的平衡；然而，长期处于应激状态势必影响其能量供给和细胞健康，最终导致生长和抗病等方面机能的降低。