石菖蒲有效成分对APP/PS1双转基因小鼠GAP-43表达的影响

孙晓雪 王宁宁 李琳 荣华

【摘要】 目的：觀察石菖蒲有效成分β-细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP-43）表达的影响，探讨β-细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠神经突触可塑性的保护作用及对阿尔茨海默病（AD）的治疗作用机制。方法：选取2019年3-4月40只2月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组，盐酸多奈哌齐组，低剂量组及高剂量组，每组10只，选用10只相同月龄C57BL/6小鼠为空白对照组。空白对照组与模型组分别给予0.1 mL/10 g 0.9%氯化钠溶液，盐酸多奈哌齐组给予0.33 mg/（kg·d）盐酸多奈哌齐，低剂量组给予β-细辛醚25 mg/（kg·d），高剂量组给予50 mg/（kg·d）β-细辛醚，五组均连续灌胃4周。采用Morris水迷宫法检测并比较各组学习记忆能力，采用免疫荧光法检测并比较各组海马区GAP-43蛋白的表达变化，采用RT-PCR技术检测并比较各组海马区GAP-43mRNA表达水平。结果：模型组、盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组逃避潜伏期均高于空白对照组，且跨越平台次数均低于空白对照组（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组逃避潜伏期均低于模型组，且跨越平台次数高于模型组（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组与高剂量组逃避潜伏期均低于低剂量组（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组与高剂量组跨越平台次数均高于低剂量组，且高剂量组高于盐酸多奈哌齐组（P<0.05）。模型组、盐酸多吗哌齐组、低剂量组与高剂量组GAP-43蛋白与GAP-43mRNA表达量均高于空白对照组（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组GAP-43蛋白与GAP-43mRNA表达量均低于模型组（P<0.05）。结论：β-细辛醚具有改善AD的作用，并且作用机制与调控小鼠海马神经突触可塑性相关因子GAP-43的表达相关。

【关键词】 阿尔茨海默病 β-细辛醚 APP/PS1双转基因小鼠 神经生长相关蛋白43

Effects of Active Ingredients of Acorus Tatarindii on GAP-43 Expression in APP/PS1 Double Transgenic Mice/SUN Xiaoxue， WANG Ningning， LI Lin， RONG Hua. //Medical Innovation of China， 2020， 17（25）： 0-025

[Abstract] Objective： To observe the effect of β-asarone on the expression of growth-associated protein 43 （GAP-43） in APP / PS1 double transgenic mice， and to explore the protective effect of β-asarone on the synaptic plasticity of APP / PS1 double transgenic mice and the therapeutic mechanism of β-asarone on Alzheimers disease （AD）. Method： From March to April 2019， a total of 40 APP/PS1 double transgenic mice with 2 month old were randomly divided into model group， Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group， with 10 mice in each group. 10 mice with C57BL/6 in the same month age were selected as blank control group. The blank control group and model group were given 0.1 mL/10 g 0.9% sodium chloride solution. The Donepezil Hydrochloride group was given 0.33 mg/（kg·d） Donepezil Hydrochloride. The Low-dose group was given 25 mg/（kg·d） β-asarone. The high-dose group was given 50 mg/（kg·d） β-asarone. All the five groups were given gavage for 4 weeks. The learning and memory ability of each group were detected and compared by Morris water maze method. The expression of GAP-43 protein of each group were detected and compared by immunofluorescence method. The expression of GAP-43 mRNA in hippocampus of each group were detected and compared by RT-PCR. Result： The escape latency of model group， the Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were higher than that of blank control group， and the number of crossing the platform were lower than that of the blank control group （P<0.05）. The escape latency of the Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were lower than that of model group， and the number of crossing the platform were higher than that of model group （P<0.05）. The escape latency of the Donepezil Hydrochloride group and the high-dose group were lower than that of low-dose group （P<0.05）. The number of crossing the platform in the Donepezil Hydrochloride group and the high dose group were higher than those in the low-dose group， and the high dose group was higher than the Donepezil Hydrochloride group （P<0.05）. The expression levels of GAP-43 protein and GAP-43 mRNA in the model group， Domperidone Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were higher than those in the blank control group （P<0.05）. The expressions of GAP-43 protein and GAP-43 mRNA in the Donepezil Hydrochloride group， low-dose group and high-dose group were lower than those in the model group （P<0.05）. Conclusion： β-asarone has the effect of improving AD， and the mechanism of action is related to the regulation of the expression of GAP-43， a synaptic plasticity-related factor in hippocampus of mice.

[Key words] Alzheimers disease β-asarone APP/PS1 double trangsgenic mice GAP-43

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.25.006

阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是与机体开始出现老化有很大关联的一种中枢神经退行性疾病。由于当今世界人口老龄化趋势越来越严重，除肿瘤及心血管疾病外，阿尔茨海默病现已是最为严重的老年人疾病及导致死亡的主要因素[1]。AD典型病理特征主要为细胞外部形成老年斑、细胞内部纤维缠结以及在脑组织中积聚大量Aβ-蛋白的现象，能够对神经突触的完整性和可塑性起到一定的破坏作用，使部分突触丢失及功能丧失[2-3]。阿尔茨海默病早期明显病理表现主要有脑部突触丧失，突触发生损害为记忆出现障碍的基础[4]。目前对于AD的治疗效果并不十分理想，不能够从根本上达到治疗该疾病的效果。依据现代药理学研究可得知，中药石菖蒲具有很好的镇静、益智健脑、抗抑郁等作用，在临床中被经常用于治疗AD、癫痫、脑中风等神经系统疾病，其主要成分为β-细辛醚[5]。因此，本研究通过观察β-细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠（AD模型小鼠）生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP-43）表达的影响，从突触可塑性角度来探讨石菖蒲主要成分β-细辛醚对AD疾病的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取2019年3-4月雄性2月龄APP/PS1双转基因小鼠40只，另选取同源同月龄相同遗传背景C57BL/6小鼠10只。购于南京大学-南京生物医药研究院，生产许可证编号：SCK（苏）2015-0001。饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心SPF级饲养室。

1.1.2 药物与试剂 β-细辛醚由天津一方科技有限公司提供（CAS：00011017-T9K），盐酸多奈哌齐（donepezil hydrchloride tablets，DHT）由卫材（中国）药业有限公司提供（CAS：C14200012042），GAP-43一抗抗体由SANTA 公司提供（CAS：sc-33705）。

1.2 方法

1.2.1 分組及给药 将APP/PS1双转基因小鼠40只随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组，低剂量组及高剂量组，每组10只，10只C57BL/6小鼠作为空白对照组。空白对照组与模型组分别给予0.1 mL/10 g 0.9%氯化钠溶液;盐酸多奈哌齐组给予0.33 mg/（kg·d）盐酸多奈哌齐;低剂量组给予β-细辛醚25 mg/（kg·d）;高剂量组给予50 mg/（kg·d）β-细辛醚。五组均连续灌胃4周。

1.2.2 学习记忆能力检测 灌胃4周后，应用水迷宫方法对各组进行行为学测试。采用直径为150 cm，高为60 cm的圆形不锈钢水池，内置高为40 cm，底面为6 cm×10 cm无色有机玻璃平台（安全平台）。中心作为原点，在水池四周侧壁上标记东、南、西、北4个方向并作为进入水池点。安全平台放入水池中，方向为西南象限正中距池侧壁22 cm处，注水，水温调控为（22.0±1.0）℃，加入适量奶粉，使水呈乳白色。安全平台低于液面1 cm，练习期间周围保持安静，参照物不发生变化。（1）定位巡航实验。实验时间为5 d，4次/d，选取东侧为作为进入水池的点，自动摄像系统记录小鼠寻找安全平台时间（逃避潜伏期）设定时间为60 s。（2）空间探索实验。在定位航行实验结束后，撤出水下安全平台，在相同的入水点，小鼠面向水池壁方向放入水中，拍摄小鼠在没有安全平台的情况下寻找记忆中安全平台的次数（跨越平台次数），设定时间为60 s。

1.2.2 免疫荧光标记检测各组海马CA3区GAP-43蛋白表达 行为学测试结束后断颈法处死小鼠，冰上快速剥离海马组织，多聚甲醛溶液固定24 h。将组织切片至于甲醇溶液中室温浸泡10 min，清洗液反复冲洗3次，3 min/次，高压修复2 min后冷却至室温，37 ℃条件下免疫血清封闭30 min，低价适当比例稀释的一抗工作液，4 ℃过夜。次日，PBS溶液冲洗切片后，滴加二抗工作液，避光反应40 min，中性甘油封片，拍摄图片。

1.2.3 RT-PCR检测各组海马区GAP-43mRNA表达 行为学测试结束后，冰上快速取脑，迅速剥离海马，应用眼科剪，将小鼠海马组织剪成乳糜状，按要求比例，每50 mg海马组织加入1 mL的TRIzon试剂，使用移液器将液体吸入到预先高压处理过的EP管中。加入氯仿，每使用1 mL的TRIzon试剂加入0.2 mL的氯仿，将EP管盖盖好后，使用涡旋仪剧烈震荡15 s，室温放置3 min。加入DEPC水30 ?L，使RNA充分溶解，配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，吸取2 ?L的RNA样品，加入1 ?L的上样缓冲液，混匀加入配好的琼脂糖凝胶中进行电泳，鉴定所提RNA的纯度及完整性。在冰上配制反应体系试剂，在ABI7300荧光定量PCR仪器上进行PCR的反应，按照说明书设置PCR的扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40个循环。由上海生工生物工程有限公司设计合成引物，引物序列如下，GAP-43：Forward：5-TGAGCCTGTCCTCTCCTACC-3;Reverse：5-CTCGCCATAACAACACCAAG-3;β-actin：Forward：5-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3;Reverse：5-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3。反应结束后，进行数据的分析与处理，通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平，Fold change=2-ΔΔCt，WhereΔΔCt=（Cttarget gene-Ctβ-actin）-（Ctcontrol-Ctβ-actin）。

1.3 观察指标 比较各组学习记忆能力、逃避潜伏期和跨越平台次数、GAP-43蛋白表达、GAP-43mRNA表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组学习记忆能力比较 模型组、盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组逃避潜伏期均高于空白对照组，且跨越平台次数均低于空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组逃避潜伏期均低于模型组，且跨越平台次数高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组与高剂量组逃避潜伏期均低于低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组与高剂量组逃避潜伏期比较，差异无统计学意义（P>0.05）。盐酸多奈哌齐组与高剂量组跨越平台次数均高于低剂量组，且高剂量组高于盐酸多奈哌齐组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

a与空白对照组比较，P<0.05;b与模型组比较，P<0.05;c与盐酸多奈哌齐组比较，P<0.05;d与低剂量组比较，P<0.05。

2.2 各组GAP-43蛋白表达变化 模型组（1.72±0.06）、盐酸多吗哌齐组（1.31±0.07）、低剂量组（1.38±0.09）与高剂量组（1.35±0.08）GAP-43蛋白表达量均高于空白对照组（1.00±0.02），差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组GAP-43蛋白表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组GAP-43蛋白表达量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.3 各组GAP-43mRNA表达情况比较 模型组（1.77±0.11）、盐酸多吗哌齐组（1.13±0.14）、低剂量组（1.21±0.11）与高剂量组（1.19±0.06）GAP-43mRNA表达量均高于空白对照组（1.00±0.06）差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组GAP-43mRNA表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。盐酸多奈哌齐组、低剂量组与高剂量组GAP-43mRNA表达量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2。

3 讨论

AD又称老年痴呆，即是在老年期出现表现为痴呆症状的疾病，与年龄密切相关，多在50岁以后起病。该疾病发病的主要临床表现为记忆力减退、严重认知障碍且伴有不可逆的行为及社交障碍[6-7]。随着病情加重，能够导致患者失去自主生活能力甚至会带来严重并发症，最终会致死亡[8-9]。

虽然对AD的研究已经有近百年历史，并且国内外研究学者也提出了很多假说，并且研发出多种药物应用于临床治疗。但是到目前为止人们对AD发病机制并不十分明确，并且药物治疗效果不够理想。突触传递是神经系统细胞间联系的主要基础，神经元对信号的接收与处理功能需要依靠突触连接来实现，所以认为突触损伤与缺失是影响认知功能的神经生物学中重要因素[10]。突触在形态结构方面、数量方面以及功能状态调节方面的可塑性很大程度上决定神经系统的可塑性[11]。

GAP-43作为重要突触蛋白，在处于轴突生长和突触发生的神经元中呈高表达，并且在神经递质释放过程中发挥着不可替代的重要功能，它同突触连接、建立及突触损伤修复过程的关系也是十分紧密。在膜信号传导系统中，G蛋白处核心地位，是信号转导因子与放大器，而GAP-43能够调控G蛋白，通过GAP-43结合到膜内表面氨基末端来完成，作为纯化蛋白质，GAP-43能够起到鸟甘氨酸释放蛋白的作用，可促使G0蛋白释放GDP、提高GTP激酶活性及与GTP结合，因此GAP-43是轴突生长、延伸的重要因子，并且可以参与信号转导。有研究发现，6周胚胎的神经系统已存在GAP-43mRNA表达，13～14周转移到突触生长的神经元内表达，表达最高水平会发生于出生后1周，在这之后随着年龄增加而不断降低[11-12]。大多数成年时脑部GAP-43含量表达水平是非常低的，但在有些脑区，如新皮质及海马的单胺神经元内，其会始终保持着较高水平的表达量。一旦发生损伤情况时，受损伤的周围神经元会通过侧枝发芽和反应性轴突再生进行功能代偿，导致GAP-43表达含量再次显著升高，并且能够随着修复过程逐渐降低，因此GAP-43可作为研究神经发育，损伤修复及神经再生的重要探针[12-13]。GAP-43能够在诱导轴突生长方面，以及调控新的突触连接形成时有着至关重要意義，是突触可塑性内在的决定因素。

中医认为AD病位是在脑。《本草备要》曰：“人之记性，皆在脑中…”中医早就已经认识到脑具有记忆、思维、感知的功能，AD发生是由于出现脑萎缩，大脑功能退化所致。《医林改错》十分明确地提出“灵机记性在脑”“脑气虚，脑缩小”“高年无记性者，脑髓渐空”[14]。在许多医治脑部疾病的中药方剂中，石菖蒲出现频率非常高，属于醒脑开窍类的中药。近些年来，对中药石菖蒲的化学成分、药理研究、临床应用等方面也有了比较系统的研究。

中药石菖蒲含挥发油（0.01%～2.15%）及糖类、机酸、氨基酸等，在挥发油中含有34种成分，主要为β-细辛醚（63.2%～81.2%）、α-细辛醚（3.4%～13.7%），其次为石竹烯、α葎草烯、石菖醚、细辛醛等[15-16]。石菖蒲挥发油的有效成分有很好的促进学习记忆的作用。药理学研究得知，石菖蒲的药理作用具有镇静、防治惊厥、益智健脑、治疗抑郁等作用，在临床应用中常被用于治疗AD、癫痫、脑中风等神经系统疾病。

本研究结果表明，模型组寻找跨越安全平台的次数明显减少，同时逃逸潜伏期有所增加，入水朝向角度也发生增大的情况，而高剂量组能够明显改善小鼠反应迟钝的行为，提高跨越平台次数，缩短逃逸潜伏期时间，缩小入水朝向角度，显著提高痴呆模型小鼠学习记忆能力，由此可以说明，β-细辛醚能够改善相似于痴呆病人的行为学症状，对这类疾病具有一定的治疗作用。

由实验结果可知，β-细辛醚能够降低痴呆模型小鼠海马区GAP-43的蛋白含量和mRNA的表达，对神经突触可塑性具有很好的保护作用。其通过调节小鼠神经突触可塑性相关功能蛋白的变化来发挥抗AD作用，为开发防治AD的新作用靶点药物提供理论研究基础。

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（收稿日期：2020-02-06） （本文编辑：田婧）