从心论治方上调PI3K/Akt磷酸化减轻HUVEC炎症损伤的体外实验研究*

李丽君 唐秋萍 顾毓艳 麦明朗 张 烯 赵海鹰 陈晓玲 周凤华△

（1.中国人民解放军联勤保障部队第九八二医院，河北 唐山 063000；2.南方医科大学，广东广州 510515）

动脉粥样硬化（AS）是急性心脑血管事件的共同病理基础，对AS的防治工作尤为重要［1］。内皮功能受损是AS的起始改变，并可作为预测心血管事件的一项指标［2］。中医认为AS病位主要在血脉，属本虚标实之证，本虚为气阴两虚，标实主要表现为“瘀毒”［3］，活血解毒兼以补气扶正为AS的主要治则。因此，笔者从对AS有显著疗效的定心方中优化出主入心经的黄连、丹参、酸枣仁与灵芝4味药材，重新组成从心论治方（CXLZF）。并在动物实验中初步证实该方能减轻ApoE敲除小鼠斑块损伤，调节血脂，然而其作用机制不清。本实验主要观察从心论治方对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤的影响，从体外水平探讨其抗AS的部分药理机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级成年雄性SD大鼠30只，体质量约200 g，购于南方医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（粤）2016-0041。

1.2 试药与仪器

从心论治方由黄连、丹参、酸枣仁及灵芝组成，中药饮片购自南方医院中药房。DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，货号：C11995500BT、10270-106；CCK-8购自日本同仁公司，货号：CK04-500T；OX-LDL购自广州奕源生物科技公司，批号：YB-002（1-002）；人源核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）与白介素-10（IL-10）ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，货号分别为：CSB-E12107h、CSB-E04740h、CSB-E04725h、CSB-E04593h；磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、p-Akt Ser473、GAPDH 抗体，均购自Cell Signaling Technology，批号依次为C73F8、C67E7、D25E6、D16H11；LY294002购自美国 Sigma公司，批号L9908；EGFP Annexin V/PI凋亡染色试剂盒，购自Gene Copoeia公司，货号：A025；微量谷胱甘肽（GSH）测试盒、乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，货号：A006-2、A020-2。超净台（苏净集团安泰公司）；低温高速离心机（美国Thermo Electron公司）；CO2恒温细胞培养箱（GALAXY公司）；全波长酶标仪（德国Thermo）；Eclipse Ti荧光倒置显微镜（日本尼康）；SDS电泳系统（北京君意东方电泳设备有限公司）；Kodak Image Station 2000MM成像系统（美国KODAK公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。

1.3 细胞培养

HUVEC（ZQ00446）购自上海中乔生物科技公司。采用含10% FBS的高糖DMEM培养基，置于5% CO2浓度、饱和湿度及37℃恒温孵育箱中培养，待细胞铺满80%～90%培养皿底部时，用0.25%胰酶消化，进行细胞传代，取对数增长期细胞进行实验。

1.4 含药血清制备

常规制备CXLZF标准水煎液，终质量浓度为2.31 g/mL，置于4℃冰箱备用。取成年雄性SD大鼠，分为实验组和对照组，实验组20只，对照组10只。实验组大鼠每日早晚各灌胃2 mL CXLZF药液，对照组灌胃同体积生理盐水，连续7 d。麻醉大鼠后行腹主动脉取血，静置30 min后3 500 r/mim离心15min，取上清，并灭活过滤，分装保存在-80℃冰箱。

1.5 细胞分组

在预实验中，已对大鼠血清浓度梯度进行筛选，根据预实验结果，将对数生长期细胞以4×106/mL的密度接种于6孔板，正常培养12 h，待细胞贴壁后随机分为6组：对照组（加入10%空白组大鼠血清正常培养）、模型组（加入100 μg/mL ox-LDL干预24 h）、从心论治方药物血清组（分别预先加入2.5%、5%、10%、20%含药血清孵育2 h，再加入100 μg/mL ox-LDL干预24 h）。

1.6 指标检测

1.6.1 细胞活力检测及形态观察 1）细胞活力检测：采用CCK-8法，取1×104/mL单细胞悬液100 μL接种到96孔板，按实验分组进行处理后，每孔加入10 μL CCK-8继续孵育4 h，用酶标仪检测OD值（波长450 nm）。2）细胞形态观察：将HUVEC接种于6孔板中，并制作细胞爬片，按分组对细胞进行相应处理后，弃培养液，用4%多聚甲醛室温下固定10 min。用PBS洗涤细胞2次，每次5 min，取出细胞爬片倒扣于载玻片上，置于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.6.2 细胞凋亡检测 细胞干预后离心收集，用PBS洗2次，每次5 min，加入100 μL 1×binding buffer重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光反应10 min。然后加入400 μL 1×binding buffer，混匀，样品立即上流式细胞仪检测（激发波长488 nm，发射波长530 nm），计算细胞凋亡指数。

1.6.3 LDH和GSH含量测定 取对数生长期细胞接种于6孔板，作以上分组和处理。收集细胞培养液，按照试剂盒说明书分别检测LDH和GSH含量。

1.6.4 炎性因子水平检测 收集细胞后用超声破裂，离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，再分别计算细胞内NF-κB、TNF-α、TGF-β与IL-10等炎性因子的水平。

1.6.5 p-Akt Ser473、Akt以及PI3K蛋白水平检测 弃去细胞培养液，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，将细胞培养皿置于冰板上，加入裂解液裂解细胞30 min，用细胞刮匙充分刮取细胞，收集所有的细胞裂解液分别置于1.5 mL离心管，12 000 r/min，4℃离心15 min，取上清液并用BCA法定量，98℃金属浴变性5 min，取等量蛋白样品，经10%的SDS-PAGE电泳分离，蛋白转移至PVDF膜上，5% BSA封闭1 h，加入相应一抗，4℃过夜或孵育12 h，次日用TBST洗膜3次，每次5 min。加入二抗，室温孵育2 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min，用化学发光法检测目的蛋白，凝胶成像仪拍照后，用Gel-Pro analyzer软件分析灰度。

1.6.6 阻断PI3K/Akt通路炎性因子水平检测 将HUVEC接种于6孔板中，取对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、模型组（ox-LDL，100 μg/mL）、CXLZF组（10%含药血清）、LY294002组（50 μM）、CXLZF+LY294002组。其中，LY294002是PI3K/Akt特异性抑制剂，需加入细胞预处理2 h。除对照组外，其余4组分别用CXLZF含药血清或LY294002预处理2 h后，再加入ox-LDL干预细胞24 h复制模型。收集细胞进行炎性因子的ELISA检测。

1.7 统计学处理

应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（）表示，单因素方差分析组间差异的显著性。P＜0.05表示组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HUVEC活力和凋亡情况的比较

见表1，图1～图2。如图1所示，与对照组比较，模型组细胞变圆，体积增大，而含药血清2.5%、5%、10%、20%组细胞逐渐恢复正常形态。CCK8结果显示，ox-LDL对HUVEC活力影响不显著，随着含药血清浓度加大，细胞活力降低，与对照组相比，含药血清10%、20%组细胞活力差异有统计学意义（P＜0.05）。如图2所示，与对照组相比，模型组细胞红色荧光表达量多且强度高，说明模型组凋亡和坏死的细胞比对照组多；与模型组相比，含药血清组红色荧光表达量均有所降低，说明药物血清可显著减轻HUVEC细胞的凋亡。

表1 各组HUVEC细胞增殖、LDH和GSH分泌比较（±s）

表1 各组HUVEC细胞增殖、LDH和GSH分泌比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05。下同

组别对照组模型组含药血清2.5%组含药血清5%组含药血清10%组含药血清20%组n 6 6 6 6 6 6光密度1.02±0.22 1.16±0.15 0.96±0.15 0.93±0.08 0.89±0.18△0.75±0.13△AI（%）5.73±0.82 16.38±3.1 12.77±1.53 13.25±3.04 7.92±1.24**9.03±2.37**LDH（U/L）232.78±39.63 415.29±73.9 296.40±10.08*281.30±29.57*225.40±9.63**236.11±5.08**GSH（μmol/L）30.36±2.70 30.45±2.05 45.07±0.77**59.93±2.02**38.47±2.92*31.25±3.47

2.2 各组HUVEC分泌LDH和GSH的比较

如表1所示，与对照组相比，模型组HUVEC分泌GSH没有显著差异，而LDH则显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，含药血清10%、20%组分泌GSH显著增加（P＜0.01），而LDH分泌量显著减少，尤其是含药血清10%、20%组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图1 各组HUVEC细胞形态的比较（200倍）

图2 各组HUVEC凋亡的比较（200倍）

2.3 各组HUVEC内炎性因子水平的比较

见表2。与对照组比较，模型组促炎因子NF-κB和TNF-α含量显著增加，抗炎因子TGF-β与IL-10水平明显降低，两者差异有统计学意义（P＜0.01）。5%、10%、20%含药血清降低了细胞内NF-κB和TNF-α水平，同时升高了TGF-β与IL-10的含量，与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示含药血清能有效降低ox-LDL诱导的HUVEC内促炎因子的释放，同时促进抗炎因子的分泌，能有效维持细胞稳态。

表2 各组HUVEC内炎性因子水平的比较（pg/mL，±s）

表2 各组HUVEC内炎性因子水平的比较（pg/mL，±s）

组别对照组模型组含药血清2.5%组含药血清5%组含药血清10%组含药血清20%组n 6 6 6 6 6 6 NF-κB 75.33±9.25 290.42±31.03 256.00±28.57 213.36±19.88*178.09±25.52**133.75±21.47**TNF-α 122.70±9.38 545.91±37.29 436.43±26.84 388.36±12.79*307.68±29.62**278.10±15.44**TGF-β 327.42±25.09 157.50±18.45 172.74±22.28 229.13±15.63*278.47±35.02**261.25±19.47**IL-10 215.33±14.52 87.51±23.79 92.46±12.83 165.77±29.13**178.82±19.07**189.54±11.63**

2.4 各组HUVEC内PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平的比较

见图3，表3。如图3所示，与对照组相比，模型组细胞PI3K、p-Akt的表达量明显降低；含药血清预处理组PI3K、p-Akt的表达量明显增加，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组HUVEC中PI3K、p-Akt表达的比较

表3 各组HUVEC内PI3K与p-Akt蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组HUVEC内PI3K与p-Akt蛋白相对表达量比较（±s）

组别对照组模型组含药血清2.5%组含药血清5%组含药血清10%组含药血清20%组n 3 3 3 3 3 3 PI3K 1.00±0.17**0.54±0.09 1.09±0.15**0.91±0.10*0.53±0.04 0.80±0.10 p-Akt 1.00±0.14**0.62±0.12 1.08±0.09**1.68±0.24**0.92±0.11*1.46±0.06**

2.5 各组阻断PI3K/Akt通路对炎性因子水平的影响

见表4。为进一步探讨CXLZF是否通过PI3K/Akt通路调节炎症因子表达，我们采用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002预先加入细胞内孵育2h，阻断该通路后发现，CXLZF对细胞内NF-κB和TNF-α的下调作用受到抑制，同时升高TGF-β与IL-10作用也低于单独应用CXLZF组。提示CXLZF减轻HUVEC炎症损伤可能是通过激活PI3K/Akt信号通路起作用。

表4 各组阻断PI3K/Akt通路对炎性因子水平的影响（pg/mL±s）

表4 各组阻断PI3K/Akt通路对炎性因子水平的影响（pg/mL±s）

组别对照组模型组CXLZF组LY294002组CXLZF+LY294002组n 6 6 6 6 6 NF-κB 92.47±7.53 342.85±38.19 186.01±16.25**273.37±29.08*214.70±19.49**TNF-α 105.24±12.06 514.83±48.31 275.62±21.38**390.74±42.9*321.55±37.48**TGF-β 279.33±21.84 123.05±12.57 231.76±28.39**159.55±18.73 225.4±24.68**IL-10 240.18±19.27 95.67±8.22 193.07±26.34**144.79±10.35 177.64±29.15**

3 讨 论

AS是大多数心脑血管疾病的共同病理基础，炎症是贯穿AS发病全过程的重要病机［4-5］。因此，抑制炎症一直是AS临床防治中的一项重要举措。AS中医辨证为痰湿瘀毒互结之证，治则以祛湿解毒活血为要。中药从心论治方从对冠心病及AS疗效显著的定心方优化而来［6-7］，主要依据“心主血脉”的中医理论，取定心方中主入心经的4味药材组合而成。君药为入中焦脾胃肝胆经之黄连，取其清热祛湿解毒功效，臣以入心、肝经之丹参活血化瘀消痈，佐以酸枣仁养心补肝，宁心安神，以灵芝滋补强壮为使药，以缓和君药黄连之苦寒。4味药材共奏清热祛湿、活血解毒、扶正益气之功效。

实验表明，从心论治方能有效减轻高脂诱导ApoE敲除小鼠主动脉AS损伤，延缓粥样斑块进展，降低血清TC、TAG与LDL-C浓度，升高HDL-C水平，减轻小鼠肝脏脂肪变性损伤，并且能显著调节T淋巴细胞免疫网络［8］，提示从心论治方抗AS损伤的机制可能与抗炎与调脂有关。

AS是一种慢性炎症性疾病，其早期阶段与血管内皮细胞中ox-LDL、氧化应激、黏附分子和炎性细胞因子水平的升高有关［9-10］。本研究发现，100 μg/mL ox-LDL对HUVEC细胞活力无显著影响，但能明显促进细胞凋亡，并且诱导细胞分泌促炎因子NF-κB和TNF-α，增加细胞内LDH释放。CXLZF含药血清干预后，能显著抑制细胞凋亡、增加细胞内抗炎因子TGF-β与IL-10的浓度，上调GSH水平，增强细胞抗氧化能力。本实验结果提示，CXLZF含药血清能减轻ox-LDL诱导HUVEC损伤，可能与抗炎及抗氧化损伤有关。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，在AS小鼠体内，其水平显著增加［11］。本实验使用eGFP Annexin V/PI检测试剂盒观测各组HUVEC凋亡情况，发现ox-LDL能显著增加HUVEC凋亡程度，含药血清10%、20%组凋亡率明显降低，提示CXLZF药物血清能减轻ox-LDL诱导的HUVEC凋亡，能有效保护细胞，但其机制不清。

为进一步明确CXLZF是否能改善HUVEC的抗氧化能力，分别检测了细胞内LDH和GSH水平。LDH存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损即被释放到细胞外。GSH是一种低分子自由基清除剂，可以清除O2、H2O2、LOOH。恢复机体GSH水平，可以抑制单核细胞分化和炎症因子的产生，部分地减轻动脉粥样硬化损伤［12］。本实验显示ox-LDL能显著诱导细胞分泌LDH，而对GSH含量影响不大，而含药血清10%、20%组能明显增加细胞GSH分泌量，而减少LDH分泌量，显著提高细胞抗氧化能力，提示CXLZF具有抗氧化作用。

ox-LDL不仅能诱导细胞氧化应激，还能导致其炎症损伤。既往研究已证实CXLZF能减轻ApoE敲除小鼠血清NF-κB和TNF-α水平，但对HUVEC作用未知。本研究中，10%、20% CXLZF含药血清能显著抑制细胞内促炎因子NF-κB、TNF-α分泌，增加抗炎因子TGF-β与IL-10浓度，从而有效减轻ox-LDL诱导的HUVEC炎症损伤。炎症的发生受一系列细胞信号通路调控，其中PI3K/Akt通路研究最广泛。激活PI3K/Akt信号通路可抑制HUVEC细胞凋亡，减轻氧化应激，提高细胞活力改善细胞形态，并抑制AS斑块的发展［10，13-17］。Western blotting结果显示，CXLZF能显著诱导Akt Ser473位点磷酸化，激活PI3K/Akt通路，从而减轻ox-LDL诱导的细胞炎症损伤。采用LY294002特异性阻断PI3K/Akt通路后，NF-κB和TNF-α水平升高、而TGF-β与IL-10浓度降低，CXLZF能部分逆转LY294002的致炎作用，说明CXLZF减轻HUVEC炎症损伤可能主要通过激活PI3K/Akt通路实现。

综上所述，CXLZF可减轻ox-LDL所造成的HUVEC损伤，机制可能涉及抗炎和抗氧化两方面，主要通过诱导Akt Ser473位点磷酸化，激活PI3K/Akt通路来起作用。