姜黄素联合有氧运动对糖尿病肝病变和肝中脂肪酸β 氧化的影响

刘晓晨,张社峰,王改凤

(1.河南财政金融学院体育系,郑州 450046; 2.河南省中医药研究院附属医院内分泌科,郑州 450004;3.河南省中医院脑病一区,郑州 450002)

在过去的50 年中,肥胖的患病率在世界范围内大规模增加,并且已经成为导致2 型糖尿病发生的重要因素,是一项重大的健康挑战[1]。 健康的生活方式、低卡路里摄入和增加能量消耗已经成为当下流行的行为干预和预防措施[2]。 姜黄素是一种天然化合物,分离自姜黄属植物,具有抗炎、降血脂、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等多种作用,并且毒副作用较低[3-6]。 近年来,姜黄素在糖尿病的治疗中的作用越来越被人们重视[1,7]。 本研究将通过使用ob/ob 糖尿病小鼠,探究有氧运动联合姜黄素是否可以更好的糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和肝的一些列病理变化,并进一步分析有氧运动联合姜黄素对糖尿病小鼠肝脂质代谢的影响,阐明有氧运动联合姜黄素改善糖尿病发病的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

32 只ob/ob 糖尿病小鼠和8 只C57/BL6J 小鼠,体重18～20 g,雌雄各半,均为4 周龄,购于南京大学南京生物医药研究院[SCXK (苏) 2015-0001],所有小鼠均饲养于河南省中医药大学动物部,饲养在屏障环境中,12 h/12 h 明暗交替环境,自由饮水和进食, 符合伦理学规定, 伦理编号20180910,并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

姜黄素粉,购自Sigma 公司(BCBL0422G);胰岛素ELISA 检测试剂盒购于Abcam 公司;血清TC、TG ELISA 检测试剂盒购买于南京建成生物工程研究有限公司;CPT-I 抗体购于Abcam 公司。 血糖试纸和血糖仪购于Roche 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组

将32 只ob/ob 糖尿病小鼠按不同性别,采用随机数字表的方法随机分为糖尿病对照组(ON 组,n=8 只),有氧运动干预组(OA 组,n=8 只),姜黄素干预组(OC 组,n=8 只),有氧运动+姜黄素干预组(OAC 组,n=8 只),另外8 只C57 小鼠作为正常对照组(NC 组)。

1.3.2 实验干预方法

有氧运动干预: 小鼠每天进行跑台训练,持续8周,速度由第1 周的15 m/min 逐渐线性增加至第4周的25 m/min,自第5 周开始保持25 m/min,至第8周实验结束,每天上午8 点开始,训练15 min。

姜黄素干预:姜黄素在使用前溶于生理盐水配成悬溶液,每天上午10 点开始,给予姜黄素50 μg/g,持续8 周。

1.3.3 葡萄糖耐受和胰岛素耐受实验

葡萄糖耐受实验(glucose tolerance test):实验小鼠禁食10 h 后,给小鼠腹膜内注射1.5 g/kg 体重的葡萄糖溶液,并在葡萄糖注射后30、60、90、120 min 后,尾静脉取血并使用血糖仪测量血糖水平。

胰岛素耐受试验(insulin tolerance test):实验小鼠禁食4 h 后,给小鼠腹膜内注射1.5IU / kg 重组人胰岛素,并在注射后30、60、90、120 min 后,尾静脉取血并使用血糖仪测量血糖水平。

1.3.4 Western blot

肝脏组织样品使用蛋白裂解液裂解后,取上清进行蛋白定量,之后加上样buffer 煮沸待用。 配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶,上样,跑胶,转膜,封闭,用特异性抗体检测蛋白条带。 CPT-I 购于Abcam 公司,GAPDH 购于武汉三鹰公司。

1.3.5 qPCR

使用Qiagen RNA 提取试剂盒提取肝组织RNA, Bio-Rad q-PCR 仪检测基因表达情况。 采用两步法PCR 扩增标准程序引物信息见表1。 Stage 1: 预变性引物,采用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) (TaKaRa) 进行定量PCR 扩增,定量PCR 体系为10 μL: SYBR;mix:5 μL;cDNA 模板:200 ng, 95℃反应30 s; Stage 2: PCR 反应95℃,5 s, 60℃反应34 s; Stage 3:在7500 Real Time PCR system 荧光定量PCR 仪上进行扩增,溶解曲线显示引物均特异, 用7500 software v2.0.1 (Applied Biosystems)进行分析。

表1 所用qPCR 引物信息Table 1 The primers used in real-time polymerase chain reaction

1.4 统计学方法

本研究中实验数据均以平均数±标准差( ¯x ±s)来表示,采用SPSS 17.0 对实验数据进行分析处理,用t 检验来分析两两计数资料比较,用重复测量方差分析方法来分析重复测量资料,独立资料之间应用单因素方差分析,P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动联合姜黄素对ob/ob 小鼠空腹血糖和葡萄糖耐受的影响

由图1A 可以看出,ON 组的空腹血糖水平显著高于NC 组,经过8 周的实验干预后,OA 组、OC组和OAC 组相比于ON 组空腹血糖水平都明显降低,并且OAC 组与NC 组没有显著性差异,已经恢复到正常的水平。 接下来为了进一步验证实验干预对ob/ob 小鼠对葡糖糖的耐受性,我们进行了葡萄糖耐受实验。 结果显示,OA 组、OC 组和OAC组相比于ON 组都增强了对葡萄糖的耐受性,并且OAC 组比OA 组和OC 组对葡萄糖的耐受性更强(图1B)。

2.2 有氧运动联合姜黄素对ob/ob 小鼠空腹胰岛素水平及胰岛素敏感性的影响

经过实验干预后,胰岛素耐受实验结果显示OA 组、OC 组和OAC 组相比于ON 组对胰岛素更为敏感的同时,OAC 组与NC 组没有显著性差异(图2A),极大的改善了ob/ob 小鼠的胰岛素抵抗情况。各组小鼠的空腹胰岛素水平也显示出同样的结果(图2B)。

2.3 有氧运动联合姜黄素对ob/ob 小鼠肝功能的影响

由图3 可以看出,NC 组小鼠血清中反应肝功能的指标胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)均低于ON组,经过8 周的实验干预后,OA 组、OC 组和OAC 组血清中的TC 和TG 水平均显著低于ON 组(图3A,3B),进一步通过肝HE 染色结果发现,实验干预明显减轻了糖尿病小鼠肝的脂肪性病变(图3C)。

2.4 有氧运动联合姜黄素对ob/ob 小鼠肝纤维化的影响

图4 中qPCR 结果显示,ON 组肝中导致肝纤维化的胶原沉积相关基因的表达显著高于正常对照NC 组(图4A ～4C)。 经过8 周的实验干预后,OA组、OC 组和OAC 组小鼠肝中胶原沉积相关基因的表达显著低于ON 组,并且OAC 组与NC 组没有显著差异,恢复到正常小鼠的水平。

图1 各组小鼠空腹葡萄糖水平和葡萄糖耐受试验Figure 1 Fasting glucose level and glucose tolerance test results in each group of mice

图2 各组小鼠空腹胰岛素水平和胰岛素耐受试验Figure 2 Fasting insulin levels and insulin resistance test results in each group of mice

2.5 有氧运动联合姜黄素对ob/ob 小鼠肝中脂肪酸合成和分解代谢的影响

图5 中qPCR 结果显示,肝中脂肪酸合成相关基因的表达检测结果显示,经过实验干预后,肝中脂肪酸的合成并没有显著改变(图5A,5B)。 与NC对照组相比,ON 组肝中脂肪酸β 氧化相关基因的表达显著降低。 经过实验干预后,OA 组、OC 组和OAC 组肝中脂肪酸合成相关基因的表达明显高于ON 组,并且OAC 组与NC 组没有显著差异,达到正常水评(图5C,5D)。 这些实验结果表明,实验干预促进了小鼠肝中脂肪酸β 氧化从而改善了ob/ob 小鼠的糖尿病症状。

2.6 有氧运动联合姜黄素对ob/ob 小鼠肝CPT-I表达的影响

图6 中Western blot 结果显示,与正常对照NC组相比,ON 组小鼠肝中脂肪酸β 氧化中的限速酶肉碱脂酰转移酶Ⅰ(carnitine palmityl transferaseⅠ,CPT-I)表达量明显降低。 经过实验干预后,OA 组、OC 组和OAC 组肝中乙酰CoA 羧化酶和脂肪酸合成酶含量明显高于ON 组,并且OAC 组已经降到与正常对照NC 组相同水平。 这些实验结果表明,实验干预明显促进了糖尿病小鼠肝中肉碱脂酰转移酶Ⅰ的表达,从而促进了小鼠的脂肪酸β 氧化,达到缓解糖尿病的症状,并且OAC 组效果最为显著。

3 讨论

近年来,糖尿病的发病逐年上升,已经成为比肩癌症和心脑血管疾病的慢性疾病[8-9]。 预防和治疗糖尿病是一个复杂的过程,“五驾马车”理论已经让大量糖尿病患者受益。 目前,糖尿病的预防和治疗方面的研究主要以有氧运动以及长期的药物治疗为主。 有氧运动可以促进葡萄糖转运载体-4 的表达,从而增强骨骼肌对葡萄糖的摄取并减轻胰岛素抵抗[10-11]。 有氧运动过程中可以增强能量消耗,促进机体内的脂质分解,并进一步增加外周组织对葡萄糖的摄取和胰岛素的分泌[12]。 之前的大量研究结果显示,肌肉血管内皮生长因子在有氧运动过程中可以增强毛细血管的再生功能,为骨骼肌提供充足的营养,调节机体的新陈代谢,提高线粒体数量和相关酶的活性,提高骨骼肌的耗氧量,此外还对心肺功能和心脑血管功能具有重要的调节作用[13-14]。 姜黄素是提取自姜黄属植物根茎中的一种有效成分,是一种多酚类化合物。 姜黄素同时具有2 邻甲基化的酚和β-二酮功能基团,与机体的多种生物学功能紧密相关。 之前对姜黄素的研究大部分关注的是其在抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂以及免疫调节等方面。 最近几年由于姜黄素天然毒性低、结构清楚,以及对其药理学研究的不断深入,逐渐发现其在糖尿病及相关并发症中的调控作用。

图3 各组小鼠肝病变情况Figure 3 Liver lesions in mice of each group

图4 各组小鼠肝脏纤维化结果Figure 4 Results of liver fibrosis in each group of mice

图5 各组小鼠肝脂肪酸合成和脂肪酸β 氧化情况Figure 5 Results of fatty acid β-synthesis and oxidation in the liver of each group

图6 各组小鼠肝中CPT-I 表达量Figure 6 The expression of CPT-I in the liver of each group of mice

本研究中使用ob/ob 糖尿病小鼠为研究对象,探讨有氧运动联合姜黄素治疗方法对糖尿病小鼠发病情况的影响。 ob/ob 糖尿病小鼠是瘦素缺失的小鼠,自出生6 周后就可表现出肥胖、空腹血糖升高、胰岛素抵抗和脂肪肝等症状,是2 型糖尿病相关研究中常用的模型小鼠。 在本实验中,经过8 周的干预后,糖尿病对照ON 组小鼠的空腹血糖水平明显高于正常对照NC 组,经过有氧运动或姜黄素干预后,葡萄糖耐受和胰岛素耐受实验结果显示OA组或OAC 组小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗情况明显减轻,并且空腹血糖和空腹胰岛素水平明显低于ON 组。 有氧运动联合姜黄素干预使小鼠的空腹血糖和胰岛素恢复到正常水平,并且OAC 组的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗情况也和NC 组没有明显差异。

肝作为胰岛素发挥功能的主要靶器官,在机体发生胰岛素抵抗时会发生脂质代谢的紊乱,导致肝功能受到破坏、甚至发生脂肪肝。 我们通过ELISA检测小鼠血清中的TC 和TG 发现,经过实验干预后,这些指标均呈现不同程度的降低,并且以OAC组的下降最为明显,几乎达到正常对照NC 组水平。肝HE 染色的结果进一步证实了经过实验干预后,OAC 组肝脂肪性病变的改善最为明显。 通过q-PCR 检测引起肝发生病变的纤维化相关基因的表达发现,经过实验干预后,OA 组、OC 组和OAC 组均显著低于ON 组,表明糖尿病小鼠的肝病变得到缓解。 有氧运动可以显著降低机体的体重以及体脂含量,调节机体的脂质代谢状态。 脂质的代谢过程非常复杂,涉及到脂肪酸的合成和脂肪酸β 氧化等。 脂质代谢的具体过程是组织中的脂肪酸被脂肪酶水解成甘油单酯和游离脂肪酸,进入机体循环被吸收后,在小肠中重新合成甘油三酯,并进一步形成乳糜微粒,最终由淋巴系统进入血液循环运送到外周组织中的过程。 研究人员发现,经过实验干预后,糖尿病小鼠肝中脂肪酸合成相关基因FAS 和SCD 的表达并没有发生改变,ON 组、OA 组、OC 组和OAC 组均显著高于正常对照NC 组。 但是脂肪酸β 氧化相关基因LCD 和UCP2 的表达在OA 组、OC 组和OAC 组均呈现不同程度的下降,OA 组、OC组显著低于糖尿病对照NC 组,OAC 组达到正常对照组NC 组水平。 Western blot 实验结果显示ON 组糖尿病对照小鼠肝中脂肪酸β 氧化的限速酶CPT-I显著低于正常对照NC 组,经过实验干预后,OA 组、OC 组和OAC 组小鼠肝脏中CPT-I 表达明显上升。因此,本研究发现有氧运动联合姜黄素治疗可以CPT-I 的表达,进而促进脂肪酸的β 氧化,减轻由糖尿病引起的胰岛素抵抗、肝纤维化和脂肪肝的一些列病理性变化,有望成为糖尿病的预防和治疗的新方法。