紫苏叶多酚超声辅助聚乙二醇提取工艺优化及抗氧化活性研究

茹巧美 任国平 胡 琼

(杭州万向职业技术学院康养旅游系，浙江 杭州 310023)

紫苏[Perillafrutescens(L.) Britt]系唇形科一年生草本植物，广泛分布于东南亚国家，是中国卫生部颁布的第一批药食同源植物[1]。紫苏叶具有抗过敏、抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗抑郁、止咳作用，主要归因于其高含量生物活性物质，特别是酚类、黄酮、三萜类、挥发性化合物等[2]。

常见的多酚提取方法主要有超临界流体萃取[3]、加压液相萃取[4]、酶解法[5]和溶剂浸提法[6]等。溶剂浸提多酚是一种较为传统的操作，其中乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等是提取多酚的主要有机溶剂[7]。近年来，亚临界水[8]、β-环糊精[9]、深度共晶溶剂—甘油水溶液[10]等多酚绿色提取剂已被开发。聚乙二醇是一种非挥发性且具有一定稳定性的有机溶剂，与水有良好的混溶性且成本低，是一种环境友好型溶剂，被广泛应用于双水相萃取以及浊点萃取等提取试验[11]。试验拟以紫苏叶为原料，采用超声辅助聚乙二醇提取紫苏叶多酚并研究其抗氧化活性，旨在为紫苏叶多酚的绿色提取及工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

紫苏叶：红叶紫苏，产地浙江湖州；

聚乙二醇-200(平均分子量为200的聚乙二醇)、没食子酸(GAE)：分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

超声波清洗器：KH5200DB型，昆山禾创超声仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9240A型，上海精宏实验设备有限公司；

电子天平：BSA224S型，赛多利斯科学仪器有限公司；

台式高速冷冻离心机：TGL-16M型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

旋转蒸发器：R502B型，上海申生科技有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV-5800PC型，上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜无虫害紫苏叶洗净，自然风干后磨粉过200目筛，装袋密封后于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 紫苏叶多酚提取工艺 取适量紫苏叶粉，与聚乙二醇混合均匀，在不同条件下进行超声波辅助(超声频率40 kHz)提取，迅速冷却至室温，11 000 r/min离心20 min，收集上清液，测定多酚含量。

1.2.3 单因素试验

(1) 聚乙二醇浓度：固定液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)30∶1 (mL/g)，超声功率140 W，超声时间40 min，考察聚乙二醇浓度(50%，60%，70%，80%，90%)对多酚提取率的影响。

(2) 液料比：固定聚乙二醇浓度70%，超声功率140 W，超声时间40 min，考察液料比[V聚乙二醇∶m紫苏叶为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]对多酚提取率的影响。

(3) 超声功率：固定聚乙二醇浓度70%，液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)30∶1 (mL/g)，超声时间40 min，考察超声功率(100，120，140，160，180，200 W)对多酚提取率的影响。

(4) 超声时间：固定聚乙二醇浓度70%，液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)30∶1 (mL/g)，超声功率140 W，考察提取时间(20，30，40，50，60 min)对多酚提取率的影响。

1.2.4 响应面试验 基于单因素试验结果，根据Box-Behnken中心原理，以聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间为自变量，多酚提取率为响应值设计响应面分析试验。

1.2.5 多酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法[12]。

1.2.6 抗氧化活性测定

(1) ·OH清除率：参照Shen等[13]的方法稍作改动。分别取1.0 mL水杨酸(6 mmol/L)、0.5 mL FeSO4(17.5 mmol/L)于比色管中，加入1.0 mL不同质量浓度的紫苏叶多酚溶液，再加入0.5 mL H2O2(8.8 mmol/L)启动反应，37 ℃水浴30 min，测定532 nm处吸光度，以70%聚乙二醇代替样品溶液为空白组，以去离子水代替H2O2为对照组，按式(1)计算·OH清除率。

(1)

式中：

E——自由基清除率，%；

A0——空白组吸光度；

A1——样品组吸光度；

A2——对照组吸光度。

(3) DPPH·清除率：参照Pandey等[15]的方法略作改动。取1.0 mL不同质量浓度的紫苏叶多酚溶液，加入3.0 mL DPPH(0.2 mmol/L)溶液摇匀，避光室温保存30 min，测定517 nm处吸光度，以70%聚乙二醇溶液作空白，按式(1)计算DPPH·清除率。

(4) 还原力：参照Rozi等[16]的方法略修改。取1 mL不同质量浓度的紫苏叶多酚溶液，加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 mL铁氰化钾(1.0%)，混匀，50 ℃水浴20 min，以2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应。3 000 r/min 离心10 min，取上清液5 mL，加入4 mL去离子水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，室温放置10 min，测定700 nm处吸光度。

1.3 数据处理

所有试验平行3次，采用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计与统计分析；采用SPSS 22.0、Origin 9.0软件进行数据处理与制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 聚乙二醇浓度对紫苏叶多酚提取率的影响 由图1 可知，多酚提取率随聚乙二醇浓度的增加先增大后降低，当聚乙二醇浓度为60%时多酚提取率最大，为17.92 mg GAE/g·DW。这可能是有一部分植物多酚以与蛋白质结合的形式存在，有机溶剂浓度过高会使蛋白质变性，不利于此部分多酚溶出[17]。因此，确定聚乙二醇浓度为60%。

2.1.2 液料比对紫苏叶多酚提取率的影响 由图2可知，多酚提取率随液料比的增加先显著增加后略有下降，当液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)为40∶1 (mL/g)时多酚提取率最高，为17.55 mg GAE/g·DW。这主要是因为增加液料比，固液两相的接触面积增加，同时溶质与溶剂之间的浓度差增大，有利于多酚物质由原料向溶剂扩散，聚乙二醇中溶解的多酚也不断增多；而过多的提取剂导致其他杂质成分如半纤维素、叶绿素等的溶出量增多，影响多酚物质的提取，同时增加热负荷以及提取时间，回收溶剂成本也有所增高[18]。综合考虑，液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)固定为40∶1 (mL/g)。

图1 聚乙二醇浓度对紫苏叶多酚提取率的影响

图2 液料比对紫苏叶多酚提取率的影响

2.1.3 超声功率对紫苏叶多酚提取率的影响 由图3可知，多酚提取率随超声功率的增大先增大后明显下降，当超声功率为140 W时达最大值(17.16 mg CGE/g·DW)。这是由于超声波引起的空化效应随超声功率的增大而增强，同时提取液温度不断上升，溶液扩散速度加快，紫苏叶粉末颗粒膨胀，促使酚类物质渗透速率加快，聚乙二醇对多酚的溶解度逐渐增加，但超声功率过高，热效应显著，会导致酚类物质结构遭到破坏，部分多酚分解，提取率下降[19]。因此超声功率宜选择140 W。

2.1.4 超声时间对紫苏叶多酚提取率的影响 由图4可知，多酚提取率随超声时间的增加先增大后减少，当超声时间为60 min时提取率最高，达17.68 mg GAE/g·DW。Kazemi等[20]表明，超声辅助提取过程中，较长的超声时间有助于细胞壁的进一步破坏和酚类物质的渗透，提取率增加。而超声时间过长，多酚会氧化为醌类物质或者分解，不利于多酚提取[21]。因此，最佳超声时间为60 min。

图3 超声功率对紫苏叶多酚提取率的影响

图4 超声时间对紫苏叶多酚提取率的影响

2.2 紫苏叶多酚提取工艺参数优化

2.2.1 响应面试验设计与结果 在单因素试验的基础上，以聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间为自变量，以多酚提取率为响应值进行四因素三水平响应面优化试验，因素水平表见表1，试验设计与结果见表2。

2.2.2 回归模型的建立与方差分析 通过Design Expert 8.0.6软件对表2进行多元回归拟合，得二次多项回归方程为：

(2)

表1 响应面试验因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计与结果

2.2.3 两因素间交互作用 由图5可知，多酚提取率随聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间的增加呈先增大后减小的趋势。其中，聚乙二醇浓度和超声功率对响应值的影响大，表现曲面较陡，聚二乙醇浓度对多酚提取率的曲线更陡峭，说明聚乙二醇浓度影响更大；而液料比和超声时间的曲面相对较平缓，说明对多酚提取率影响较小。聚乙二醇浓度与超声功率的交互作用显著，但其余各因素间的交互作用不显著，与表3结果相符，说明该模型可以较好地描述聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间4个因素对紫苏叶多酚提取率的影响。

表3 回归模型方差分析†

2.2.4 最佳工艺条件预测与验证实验 由Design Expert 8.0.6软件预测紫苏叶多酚的最佳提取条件为：聚乙二醇浓度68.31%、液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)46.00∶1 (mL/g)、超声功率157.18 W、超声时间67.45 min。考虑实际条件的可操作性，将最佳提取工艺调整为：聚乙二醇浓度68%、液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)46∶1 (mL/g)、超声功率157 ℃、超声时间67 min。在此条件下进行3次验证实验，所得紫苏叶多酚提取率为18.21 mg GAE/g·DW，与预测值18.38 mg GAE/g·DW接近，说明该模型对紫苏叶多酚提取工艺条件参数优化可靠，具有较好的应用价值。此外，聚乙二醇—超声辅助提取的紫苏叶多酚得率略高于乙醇—微波辅助提取的(15.744 mg/g·DW)[22]。

图5 各因素交互作用对紫苏叶多酚提取率的影响

2.3 紫苏叶多酚的抗氧化活性

2.3.1 ·OH清除能力 由图6可知，当质量浓度为10～100 μg/mL时，紫苏叶多酚对·OH有明显的清除能力，且清除活性随多酚质量浓度的增加而增强。当质量浓度≤20 μg/mL时，紫苏叶多酚和维生素C对·OH的清除率没有显著差异；当质量浓度≥40 μg/mL时，紫苏叶多酚对·OH的清除率低于同质量浓度维生素C。紫苏叶多酚对·OH的最大清除率为81.69%，低于维生素C的(96.21%)，且紫苏叶多酚和维生素C对·OH清除率的IC50分别为62.62，50.84 μg/mL，说明紫苏叶多酚具有较好的·OH清除能力。

图6 紫苏叶多酚对·OH的清除能力

图7 紫苏叶多酚对的清除能力

2.3.3 DPPH·清除能力 由图8可知，当质量浓度为10～100 μg/mL时，紫苏叶多酚对DPPH·的清除率随质量浓度的增加而增加；当质量浓度≤40 μg/mL时，紫苏叶多酚和维生素C对DPPH·的清除率没有显著差异；当质量浓度≥60 μg/mL时，紫苏叶多酚对DPPH·的清除率低于同质量浓度维生素C；当质量浓度为100 μg/mL时，紫苏叶多酚和维生素C对DPPH·的清除率分别为82.26%，98.87%，IC50分别为53.44，49.51 μg/mL，表明紫苏叶多酚具有较强的DPPH·清除能力。

2.3.4 还原能力 由图9可知，当质量浓度为10～100 μg/mL 时，多酚对铁离子的还原力随质量浓度的增大呈上升趋势；当质量浓度为100 μg/mL时，紫苏叶多酚还原力为维生素C的72.53%。紫苏叶多酚和维生素C对还原力的IC50分别为32.57，13.71 μg/mL，表明紫苏叶多酚具有较好的还原力。

3 结论

试验表明，超声辅助聚乙二醇提取紫苏叶多酚的最佳工艺为聚乙二醇浓度68%、液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)46∶1 (mL/g)、超声功率157 W、超声时间67 min，此条件下多酚提取率为18.21 mg GAE/g·DW。抗氧化试验表明，紫苏叶多酚具有较好的抗氧化性能，量效关系明显，说明紫苏叶多酚可开发为食品、化妆品、药品等行业的天然抗氧化物。后续需利用大孔吸附树脂和色谱等方法进行分离纯化、结构鉴定及活性评价。

图8 紫苏叶多酚对DPPH·的清除能力

图9 紫苏叶多酚的还原能力