IL-1通过Wnt/β-catenin信号通路调控椎间盘退变研究

毛强 何帮剑 张圣扬 王萍儿 徐涛涛 华江

腰痛是临床常见的脊柱病症［1］。引起腰痛的原因很多，其中椎间盘退变（Intervertebral disk degeneration，IDD）被认为是腰痛的最主要原因［2］。目前虽然对IDD的病理进程认识比较清楚，但其潜在的细胞和分子机制仍未完全阐明［3］。目前临床上针对腰痛的治疗方法较多，但这些手段均以缓解疼痛为目的，未对引起腰痛的根本原因椎间盘退变起干预作用。椎间盘内炎性因子水平的上升是椎间盘退变的主要起始事件，其中IL-1 扮演了最重要的角色［4-5］，其在退变椎间盘中的活性呈显著升高状态。此外，有研究证实Wnt/β-catenin信号通路在椎间盘退变病理进程中发挥关键作用，而IL-1 可通过激活结肠癌细胞中的Wnt/β-catenin 信号通路促进肿瘤的生长，表明IL-1 与Wnt/β-catenin 信号通路间存在密切联系。本资料通过IL-1 干预以及构建椎间盘退变模型，探究IL-1 对椎间盘退变影响及其与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级雌性C57bl/6 小鼠，体质量20～30g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养条件：恒温，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，光照每12h 明暗交替，换风次数15～20 次/h。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养。实验饲养室许可证号SYXK（浙）2018-0012。

1.2 试剂 戊巴比妥钠（上海源叶生物科技有限公司）；二甲苯、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；苏木素染液、组化试剂盒、DAB kit、中性树胶（北京百奥思科生物医学技术有限公司）；抗体β-catenin、IL-1、Collagen Ⅱ、Versican（ 美 国Abcam 公 司）；GAPDH 抗体（杭州华安生物有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒、化学发光检测试剂、预染蛋白marker（北京索莱宝科技有限公司）；Trizol（生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green qPCR 试剂盒、逆转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.3 仪器 J3353 型X 光机（南京普爱医疗设备股份有限公司）；µCT-100 型Micro-CT（瑞士SCANCO Medical AG 公司）；ASP200S 全自动脱水机、RM2235石蜡切片机、HI1220 烤片台、G1150 H 加热石蜡包埋系统、DM3000 正置荧光显微镜（上海徕卡显微系统贸易有限公司）；EPS300 电泳仪、VE 180C 电泳槽、VE186 转膜仪（上海天能科技有限公司）；LightCycler®96 实时荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）。

1.4 方法 （1）动物分组及给药：小鼠随机分为5组，分别为正常组、IL-1 低剂量组、IL-1 中剂量组、IL-1 高剂量组、椎间盘退变模型组，每组各6 只。除椎间盘退变模型组外其余小鼠不做造模处理。其中IL-1 干预组小鼠经腹腔注射IL-1，1 次/d，低剂量组为0.04µg/10g，中剂量组为0.2µg/10g，高剂量组为1µg/10g。（2）椎间盘退变小鼠模型的制备：利用了小鼠水逃逸习惯的优势，将其放置于有限的含水空间中以诱导长时间双足姿势，增加机械压在小鼠的脊椎上。实验采用2L 塑料烧杯，让老鼠在烧杯中可以活动，自行保持双足站立动作。将模型组小鼠置于烧杯中，装有室温（24℃）水，水位设定为5mm，通过覆盖小鼠脚踝，以确保其保持双足姿势，共6h/d，自由活动、食物和水摄入2h/次，维持6 周。（3）影像学（X 线和Micro-CT）分析：各组小鼠整个腰椎节段拍摄X线片。观察腰椎结构变化：关节间隙、骨赘、骨密度等情况。用Micro-CT 分析各组小鼠腰椎显微结构的改变，3D形态计量参数包括：骨小梁相对体积（BV/TV）、骨密度（BMC/TV）、骨小梁数量（Tb. N、骨小梁密度（Tb.Th）。（4）HE 染色观察小鼠椎间盘病理学改变：小鼠腰椎组织样本置入4%多聚甲醛溶液中，24h 后锯取0.5cm 骨片，随后进行脱钙处理。将脱钙后的小鼠腰椎组织和对应标签放于脱水盒内，再将脱水盒放入吊篮置于脱水机内依次梯度脱水。脱水后将样本置入包埋机，先往包埋框倒入融化的蜡，再往上加浸好蜡的样本，放入冻台冷却，蜡凝固后取出。切片机上切片，厚4µm 后进行常规HE 染色，中性树胶封固后，通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位。（5）免疫组化检测相关蛋白表达：切片置于枸橼酸液修复液中，用微波炉100 火力30min 至微微沸腾，再用50 火力维持7min，停止加热后自然冷却20～30min，PBS 漂洗3次。3% H2O2孵育10min 以消除内源性过氧化物酶活性，PBS 洗3 次，滴加封闭液（5%BSA），湿盒中室温30min，擦去封闭液后滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜，PBS 洗去一抗。滴加生物素化二抗工作液，孵育20min，PBS 洗去二抗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，孵育20min。DAB 显色剂显色，自来水充分冲洗。再进行苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。（6）Western blot 检测相关蛋白表达：取100mg 椎间盘组织样品置于培养皿中，加入适量液氮，用研钵充分研磨，加入Lysis Buffer，组织匀浆机中进行匀浆（3×20s），使组织尽量碾碎，冰上静置裂解15～30min。将匀浆液放入离心管中，12000g，4℃离心5min，取上清转移至新的预冷的离心管中，用BCA 试剂盒测浓度，处理蛋白随后上样。用SDS-PAGE 分离总蛋白，随后用湿转法转移至PVDF 膜上，一抗4℃过夜，二抗室温孵育2h 后显影。（7）qRT-PCR 检测相关基因表达：将100mg 组织加入1ml 的Trizol 至匀浆管中，将裂解后样品室温放置5min，使得核mRNA与核酸完全分离。按照逆转录试剂盒说明书要求逆转录mRNA 为cDNA 作为模板，通过SYBR Green qPCR试剂盒要求进行qRT-PCR 反应，引物信息如表1 所示。PCR 反应条件为：95℃变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，40 次循环。

表1 引物序列信息

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用独立样本t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X 线观察各组小鼠腰椎结构变化 正常组小鼠脊柱呈正常生理弯曲，椎间隙未见明显变窄，椎体排练整齐。模型组、IL-1 干预组相较于正常组，侧位X 光可见，模型组小鼠脊柱弯曲明显，正位X 光也可见小鼠脊柱由侧图表现，椎间隙相较于正常组变窄。椎间盘退变严重程度从高到低依次为IL-1 高剂量组、椎间盘退变模型组、IL-1 中剂量组、IL-1 低剂量组、正常组。见图1。

图1 X线观察各组小鼠腰椎结构变化

2.2 Micro-CT 分析各组小鼠腰椎显微结构改变 图2为Micro-CT 拍摄结果图，由表2 分析可知，BMC/TV及Tb.N 两个数据，模型组较正常组明显降低，且有显著性差异（P＜0.01）；IL-1 干预组BMC/TV 和Tb.N 两个指标较正常组数值明显降低，其中IL-1 中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05 或0.01）。而各组的BV/TV 和Tb.Th 两个数值无明显差异。

图2 Micro-CT观察各组小鼠腰椎显微结构改变

表2 各组小鼠腰5锥体Micro-CT检测结果［n=6，（±s）］

表2 各组小鼠腰5锥体Micro-CT检测结果［n=6，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.05，# P＜0.01

组别 BMC/TV（mg HA/ccm） BV/TV Tb.N（1/mm） Tb.Th（mm）正常组 227.56±18.83 0.29±0.04 4.36±0.18 0.06±0.01 IL-1 低剂量组 200.74±13.90 0.30±0.03 3.70±0.21 0.06±0.01 IL-1 中剂量组 161.35±12.53* 0.26±0.07 3.39±0.08** 0.06±0.01 IL-1 高剂量组 135.72±16.01** 0.23±0.06 3.17±0.79** 0.05±0.01椎间盘蜕变模型组 156.34±9.60** 0.27±0.09 3.47±0.06** 0.05±0.02

2.3 各组小鼠椎间盘病理学改变 HE 染色结果如图3 所示，正常组小鼠椎间盘纤维环结构完整，终板软骨正常，排列紧密。IL-1 干预组及椎间盘退变模型组小鼠，可见纤维环厚度明显变薄，说明椎间隙较正常组变窄，终板软骨厚度较正常组变薄，且出现异常形态细胞。病理改变程度从高到低依次为IL-1 高剂量组、椎间盘退变模型组、IL-1 中剂量组、IL-1 低剂量组、正常组。

2.4 免疫组化检测各组小鼠相关蛋白表达 如图4 和表3 所示，各组小鼠椎间盘中均有IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ及Versican 阳性表达。IL-1、β-catenin 指标，椎间盘退变模型组及IL-1 干预组相较于正常组阳性表达明显升高（P＜0.05 或0.01），阳性表达从高到低依次为IL-1 高剂量组、椎间盘退变模型组、IL-1 中剂量组、IL-1 低剂量组、正常组。Collagen Ⅱ、Versican 指标，椎间盘退变模型组及IL-1 干预组相较于正常组阳性表达明显降低（P＜0.05 或0.01），阳性表达从高到低依次为正常组、IL-1 低剂量组、IL-1 中剂量组、椎间盘退变模型组、IL-1 高剂量组。

图3 各组小鼠椎间盘病理改变情况

图4 各组小鼠椎间盘内IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ、Versican的表达情况

表3 各组小鼠椎间盘内相关蛋白的表达情况［n=6，IOD，（±s）］

表3 各组小鼠椎间盘内相关蛋白的表达情况［n=6，IOD，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

组别 IL-1 β-catenin Collagen Ⅱ Versican正常组 1587.4±416.6 2148.7±401.7 6006.0±1618.7 2479.8±561.2 IL-1 低剂量组 1665.1±217.4 2696.1±394.4* 4951.1±957.5 2240.6±351.4 IL-1 中剂量组 1771.1±418.4 3046.8±747.9* 3119.1±909.2# 2164.3±231.6 IL-1 高剂量组 2901.4±1325.8* 7362.4±1392.0# 2763.8±330.4# 1714.2±371.5*椎间盘退变模型组 2203.4±123.1* 5091.6±1018.9# 2764.0±603.0# 1734.7±137.3*

2.5 Western blot 检测各组小鼠相关蛋白表达 如图5所示，与空白对照组比较，IL-1 低、中、高剂量干预组和椎间盘退变模型组小鼠椎间盘组织中β-catenin及IL-1 蛋白 表 达 水平显 著 上升（P＜0.05 或0.01），IL-1 中、高剂量干预组和椎间盘蜕变模型组小鼠椎间盘组织中Collagen Ⅱ及Versican 水平显著下降（P＜0.05或0.01）。

图5 各组小鼠椎间盘内IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ、Versican蛋白的表达情况与正常组比较，⋆P＜0.05，⋆⋆ P＜0.01

2.6 qRT-PCR 检测各组小鼠相关基因表达 根据图6 可得，与空白对照组比较，IL-1 中、高剂量干预组和椎间盘退变模型组小鼠椎间盘组织中β-catenin 及IL-1mRNA 表达水平显著上升（P＜0.05 或0.01），IL-1中、高剂量干预组和椎间盘退变模型组小鼠椎间盘组织Collagen Ⅱ及Versican mRNA 水平显著下降（P＜0.05或0.01）。

图6 各组小鼠椎间盘IL-1、β-catenin、Collagen Ⅱ、Versican基因的表达情况与正常组比较，⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01

3 讨论

本研究通过构建椎间盘退变小鼠模型以及IL-1 干预的方法，研究激活IL-1 的表达对小鼠椎间盘退变的影响，首先采用影像学（X 线和Micro-CT）方法观察IL-1 对小鼠椎间盘结构的影响，结果显示IL-1 干预组小鼠与椎间盘退变模型组小鼠具有相似的结构改变，证明IL-1 干预能够明显诱导小鼠的椎间盘结构发生退行性改变。进一步通过HE 染色检测IL-1 对小鼠椎间盘病理学改变的影响，结果表明，相较于正常组小鼠，IL-1 干预组和椎间盘退变模型组小鼠的椎间盘均发生明显的病理改变，且病理改变程度随IL-1 剂量的增加而增大。

Wnt/β-catenin 信号通路可调节多种细胞的增殖和分化，从而参与组织的退变和再生。Wnt/β-catenin信号通路对维持椎间盘的生长发育及功能亦有重要作用，多个研究均揭示了Wnt/β-catenin 信号通路在椎间盘退变病理进程中的关键作用［6］。β-catenin 阳性细胞伴随着椎间盘退变的进展而增加，β-catenin 蛋白的表达水平在人退变椎间盘中显著上调［7］。通过转基因技术活化小鼠椎间盘中的Wnt/β-catenin 信号通路，会诱导其椎间盘出现与人椎间盘退变类似的组织病理学表现和分子学特征［8］。由此可见，Wnt/β-catenin信号通路在椎间盘退变时被激活，并推动整个病理进程的发生和发展。本研究通过免疫组化、Western blot 以及qRT-PCR 的方法，检测IL-1 干预后小鼠中β-catenin蛋白以及mRNA水平的表达情况。结果显示，相较于正常组，IL-1 干预组和椎间盘退变模型组小鼠中IL-1 和β-catenin 的蛋白和mRNA 水平均显著增高，充分证明IL-1 能够上调Wnt/β-catenin 信号通路的活性，进而调控椎间盘病变。

椎间盘的主要成分是水、胶原和蛋白多糖，正常情况下纤维环中含有60% Ⅱ型胶原和40% Ⅰ型胶原，因此胶原的退化和减少也是椎间盘退变的主要组成部分［9］。当发生椎间盘退变时，Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）蛋白的表达显著降低，因此，能够根据Collagen Ⅱ在椎间盘中的表达量来判定椎间盘的退变程度。细胞外基质蛋白Versican 是一种分子量较大的硫酸软骨素蛋白聚糖，隶属于外源凝集素家族。研究表明Versican与椎间盘退变的发生发展具有密切的联系［10］。本研究通过免疫组化、Western blot 以及qRT-PCR 实验，检测各组小鼠椎间盘组织中Collagen Ⅱ和Versican 蛋白及mRNA 的表达量，结果表明，IL-1 干预组和椎间盘退变模型组中Collagen Ⅱ和Versican 的表达量显著降低，进一步从蛋白和分子角度证明了IL-1 能够通过Wnt/β-catenin 信号通路调控椎间盘退变。

综上所述，本研究通过IL-1 干预和构建椎间盘退变小鼠模型，采用影像学分析、检测相关蛋白和基因的表达变化等手段，证明IL-1 能够通过Wnt/β-catenin信号通路调控椎间盘退变。