miR-124通过调控PI3K/Akt信号通路对人胃癌MGC803细胞增殖与凋亡的影响

罗远 蒋海忠

胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，据2015 年我国癌症中心统计，胃癌在恶性肿瘤死亡率排名第3 位［1-2］。近年来，microRNAs（miRNAs）作为肿瘤标志物，参与胃癌的发生发展、侵袭转移及化疗抵抗，受到学术界越来越多的关注［3］。据文献报道，miRNA 发挥癌基因和抑癌基因的功能，参与细胞增殖、凋亡和分化的调控，在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用［4-5］。其中，miR-124 在多种肿瘤中发挥抑瘤基因的功能，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌［6-9］。有学者发现，miR-124 在胃癌细胞及组织中表达下调（包括人胃癌细胞MGC803），且在胃癌的发生发展中发挥重要调控作用［5，10］。但miR-124 对胃癌细胞MGC803 的生物学功能尚未深入。因此，本研究主要探讨miR-124 对人胃癌细胞MGC803 增殖、凋亡的影响，并进一步研究其调控PI3K/AKt 信号通路的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）细胞株：胃癌细胞MGC803 购自通派（上海）生物科技有限公司。（2）主要试剂：Trizol™ Reagent、Lipofectamine™ 2000 试 剂 均 购 自Invitrogen 公 司；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix 均 购 自TaKaRa 公 司；CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TransWell小室购自上海子起生物科技有限公司；miR-124 模拟 物（miR-124 mimics）、 阴 性 对 照（mimics-NC）购自上海吉玛公司；胎牛血清购自美国PeproTech公司；DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT 单 克 隆 抗 体、HRP 标 记 山羊抗兔IgG 二抗均购自美国Abcam 公司；引物均由上海生工生物工程公司设计合成（其中miR-124 引物 序 列：Forward：5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'；Reverse ：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；U6 ：Forward：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'；Reverse：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）。（3）主要仪器：1658033 小型蛋白垂直电泳转印系统（武汉科昊佳生物科技有限公司）；ABI 7500 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；美国SHELLAB 2406-2 CO2培养箱（美国SHELLAB 公司）；CLARIOstar 全功能多功能酶标仪（德国BMG LABTECH 公司）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 方法 （1）细胞培养：将胃癌细胞MGC803 培养在含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，用于后续的实验。（2）细胞转染：分别设置miR-124mimics 组与阴性对照（miR-124NC）组，待MGC803 细胞培养至对数生长期时，使用胰酶消化细胞后，洗涤2遍后应用完全培养基将细胞调至3.0×106个/ml，取200µl 细胞液接种至corning 6 孔板中培养24h。分别向三个EP 管中加入5µl LipofectamineTM2000，5µl LipofectamineTM2000+ 阴 性 质 粒miR-124 NC，5µl LipofectamineTM2000+5µl miR-124 mimics，室温静置5min 后混合，加入不含血清的DMEM 培养基调整终体积至2ml，置于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养6h后，更换完全培养基继续培养，完成MGC803 细胞转染，并继续扩大培养以用于后续实验。（3）RT-qPCR检测转染后细胞内miR-124 的表达：细胞转染成功后，采用RT-qPCR 技术检测细胞内miR-124 的表达。收集细胞后，PBS 洗涤2 遍，离心取细胞沉淀，按照Trizol™ Reagent 说明书提取胃癌细胞MGC803 的总RNA，依据4×Reverse Transcription Master Mix 试剂盒说明书将组织总RNA 逆转录为总cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 试剂盒说明书操作，以cDNA 为模板，进行荧光定量PCR 反应。反应条件：94℃ 2min，94℃20s，60℃ 30s，共40 个循环。以U6 为内参，miR-124 基因的相对表达量以2-ΔΔCt表示。（4）CCK8 检测细胞增殖水平：待转染后的MGC803 细胞生长至对数期时，使用胰酶消化细胞后，洗涤2 遍后应用完全培养基将细胞调至3.0×103个/ml，每孔（96 孔板）接种100µl 细胞液。分别培养24h、48h、72h，加入配置好的CCK8 试剂（10µl CCK8 试剂+90µl 完全培养基）孵育2h，采用酶标仪检测OD450 值。（5）细胞克隆实验：两组细胞以200 个/皿接种于60mm 的细胞培养皿（含10ml 培养液）中，置37℃、5% CO2的培养箱中孵育，2 周后肉眼可见细胞克隆的形成。小心吸弃培养液，用PBS 洗涤2 次，将两组细胞以4%的多聚甲醛固定15min，再用0.1%的结晶紫染色20min，用清水清洗染液并风干，于荧光显微镜下随机选取5 个视野统计形成的细胞克隆数（＞50 个克隆数为有效克隆）。（6）流式细胞术检测细胞凋亡：消化MGC803 细胞后使用含血清DMEM 培养基将细胞浓度调至3×105个/ml，收集对数生长的各组细胞，据说明书进行操作，采用Annexin V/PI 凋亡试剂盒检测不同时间点各组细胞的凋亡率。其中，各组样品分别加入500µl Binding Buffer，5µl Annexin V，5µl PI，混匀，室温避光反应5～15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。（7）miR-124 对MGC803 细胞PI3K/Akt 信号通路的调控作用：按照1 ∶10（g/ml）的比例加入RIPA裂解液，按BCA 蛋白定量试剂盒说明书方法测定所提取的各组细胞的总蛋白含量，以确保每组样本之间的上样量相同。裂解、提取各组蛋白后，经SDS-PAGE电泳分离，转至硝酸纤维素（PVDF）膜，将转好的PVDF 膜于5%脱脂奶粉溶液中室温封闭2h，TBST 洗涤液漂洗3～4 次。加入一抗，4℃孵育过夜。再漂洗3～4 次，加入HRP 标记的二抗体，室温孵育2h，漂洗3～4 次。化学发光检测底物ECL 工作液显色，采用Image J 图像分析系统对蛋白显影图进行灰度分析，以β-actin 为内参，分析PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT蛋白相对表达水平。再次收集MGC803 细胞后，PBS洗涤2 次，离心取细胞沉淀，按照Trizol™ Reagent 说明书提取miR-124mimics 组与miR-124 NC 组胃癌细胞MGC803 的总RNA，按细胞培养方法进行PCR 扩增，均以β-actin 为内参，分别检测PI3K、Akt 的mRNA水平。引物由上海生工生物工程公司设计提供，引物序列见表1。

表1 PI3K/Akt信号通路关键基因引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，应用单因素方差分析和LSD-t 检验比较两组间各指标水平差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后MGC803 细胞miR-124 的表达及其对细胞增殖的影响 MGC803 细胞转染miR-124 模拟物后，miR-124 的表达量为（4.15±0.18），显著高于miR-124NC 组（2.01±0.14）（t=17.984，P=0.006）。 转 染24h、4h 和72h 后，miR-124mimics 组 细 胞的OD450值分别为（0.46±0.09）、（0.86±0.08）和（1.08±0.13）；其中，转染48h 和72h 后，miR-124mimics 组显著低于miR-124 NC 组 的（1.25±0.14） 和（1.72±0.17）（t=8.245，14.257，P=0.027、0.008），结果见图1。说明转染miR-124 后，人胃癌细胞MGC803 的增殖能力降低。

图1 miR-124对MGC803细胞增殖的影响

2.2 miR-124 对MGC803 细 胞 克 隆 实 验 miR-124 mimics 组细胞克隆形成数为（71.3±4.5），显著低于miR-124 NC 组（103.8±10.1），差异有统计学意义（t=9.450，P＜0.001）。说 明 转 染miR-124 后MGC803细胞的克隆能力降低，进一步反映miR-124 可抑制人胃癌MGC803 细胞增殖。结果见图2。

图2 miR-124对胃癌MGC803细胞克隆的影响

2.3 miR-124 对MGC803 细胞凋亡的影响 细胞转 染24h、48h 和72h 后，miR-124mimics 组 细 胞凋 亡 率 分 别 为（12.70±5.14）、（51.80±8.14）% 及（70.40±7.14）%。其中细胞转染后48h 和72h 的细胞凋亡率显著高于miR-124 NC 组的（24.81±7.41）%和（33.21±8.29）%，差异具有统计学意义（t=17.565、18.147，P=0.007、0.005），结 果 见 图3。提 示 转 染miR-124 后MGC803 细胞凋亡率提高，且凋亡率随时间而不断增高。

2.4 miR-124 对MGC803 细胞PI3K/Akt 信号通路的影响 细胞转染后，miR-124 mimics 组PI3K/Akt 信号 通 路 中 关 键 靶 点PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT蛋白相对表达分别为（0.87±0.05）、（0.95±0.11）、（0.89±0.09） 和（0.91±0.10）， 均 显 著 低 于miR-124 NC 组（1.25±0.13）、（1.34±0.08）、（0.95±0.12）和（1.12±0.09）（t=13.542、15.224、4.159、12.357，P=0.007、0.008、0.035、0.006）。 同 时，miR-124 mimics 组PI3K/Akt 信号通路中PI3K 及Akt 基因相对表达分别为（0.73±0.08）和（0.64±0.11），均显著低于miR-124 NC 组（0.87±0.15）和（0.94±0.10）（t=8.365、10.324，P=0.007、0.009）。提示miR-124 可抑制胃癌细胞MGC803 的PI3K/Akt 信号通路。结果见图4。

图3 miR-124对MGC803细胞凋亡的影响

图4 miR-124对MGC803细胞PI3K/Akt信号通路的影响

3 讨论

目前，胃癌已成为我国发病率和病死率最高的常见恶性肿瘤之一［11］，据统计我国每年胃癌新发患者达70 万人［12］。由于胃癌的发病隐匿及诊断水平限制，多数胃癌患者在确诊时已经发展为中晚期，失去了手术机会，即使早期胃癌患者在接受手术治疗后仍有可能发生局部 复发或远处转移，导致治疗失败。故寻找新的药物靶点已成为近年来的研究热点，为胃癌的治疗寻找新的突破。近年研究表明miRNA 可通过调控细胞增殖、凋亡和分化，促进或抑制肿瘤的恶性表型，相比正常细胞，肿瘤组织中miRNA 存在异常表达，这些异常表达的miRNA 在肿瘤形成中可能扮演重要角色，可作为生物学特性、肿瘤病因学、组织分型和临床分级分期的分子标志物［13］。

miRNA 是一类微小非编码RNA，其长约20～22个核苷酸［11］。在众多miRNAs 中，miR-124 是一种新发现与胃癌有关的miRNA，与胃癌发生发展有密切关系［5，10］。据文献报道，miR-124 在多种肿瘤包括消化系统肿瘤的细胞或组织中均表达下调。Xie 等［14］研究发现，通过上调miR-124 表达水平，高浓度的miR-124 不仅可抑制胃癌细胞增殖，还可促进胃癌细胞凋亡的作用；同时发现，与5-氟尿嘧啶联合使用后，miR-124 对胃癌细胞的抑制作用更加明显，这为miR-124 作为胃癌治疗的潜在药物靶点提供了有力的证据。但目前国内关于miR-124 与胃癌发生发展及相关机制的研究报道较少。基于此，本研究成功将miR-124 转染至人胃癌MGC803 细胞中，并进一步考察miR-124 对胃癌细胞MGC803 增殖及凋亡的影响，结果显示miR-124mimics 组中细胞的miR-124 高表达；转染48h 后miR-124mimics 组MGC803 细胞的增殖较miR-124 NC 组显著降低；同时流式细胞术结果显示，miR-124 mimics 组MGC803 细胞凋亡率较miR-124 NC 组显著提高。由此可见，miR-124 可抑制胃癌细胞MGC803 增殖并促进MGC803 细胞凋亡。

为了进一步探讨miR-124 对人胃癌细胞MGC803增殖及凋亡的作用机制，本研究采用Western blotting法和RT-qPCR 法测定PI3K/Akt 信号通路关键靶点蛋白和mRNA 水平。研究证实，PI3K/Akt 信号通路参与调节细胞的增殖、凋亡等重要活动，其调控的失衡与多种肿瘤的发生、发展及耐药密切相关，已成为值得深入研究的治疗靶点［15］。Akt 蛋白处于PI3K/AKt 信号通路的中心位置，经磷酸化后被激活形成p-AkT，后者进一步使多个Akt 下游蛋白发生磷酸化（包括PI3K 等），从而调控肿瘤细胞的增殖与凋亡等［16］。有学者分别检测胃癌干细胞和胃癌细胞中PI3K、Akt 的表达，发现胃癌干细胞中PI3K、Akt 蛋白与mRNA 的表达明显高于胃癌细胞，推测PI3K/Akt 信号通路与胃癌进展密切相关［17］。本研究考察了miR-124 对人胃癌MGC803 细胞PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达及PI3K、Akt 基因水平，发现miR-124mimics 组上述蛋白及基因表达均较miR-124NC 组显著降低。提示miR-124 可抑制PI3K/Akt 信号通路，从而促进人胃癌MGC803 细胞凋亡，并抑制细胞增殖，与文献报道一致［16，18］。

综上所述，miR-124 可抑制人胃癌细胞MGC803的增殖，提高其细胞凋亡，其可能机制与抑制PI3K/Akt 信号通路表达有关。本研究可为胃癌的诊断与基因治疗提供参考。