葫芦素B抑制视网膜母细胞瘤细胞生长的实验研究

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是发生于儿童眼内最常见的一种恶性肿瘤，偶见成年人，对视力和生命威胁严重[1，2]。针对RB的治疗，除了手术切除病灶，化疗也非常重要。祖国传统医学在治疗各种肿瘤疾病中广泛应用，尤其是近年来开发了不少中药，这些药物具有价格低廉、副作用少、容易获取的优势，临床治疗方面正在逐步代替传统化疗药物。葫芦素B(cucurbitacin B，CuB)是葫芦素中含量最多的一种组分，具有抑制氧化反应、抑制肿瘤细胞增殖、降血脂、杀菌及消毒等药理作用[3，4]。本研究拟通过体外实验进一步探讨葫芦素对RB细胞增殖及凋亡的影响。

资料与方法

一、材料

人视网膜母细胞瘤系Y79(American Type Culture Collection，美国ATCC公司)，葫芦素B(美国Sigma公司)，MTT细胞增殖检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染试剂盒(南京建成生物研究所)，Annexin-V/PI细胞凋亡双染试剂盒，硝酸纤维素膜(上海碧云天公司)，Bax及Bcl-2抗体(上海联迈生物工程有限公司)。

二、方法

1.细胞培养：RB细胞培养于含10 %胎牛血清的培养液(链霉素100 μg/ml、青霉素100 U/ml)内，培养箱CO2体积分数为5 %，温度为37 ℃，每3 d更换一次新鲜培养液，细胞密度达到80%左右，胰酶消化后进行后续实验。

2.RB细胞分组：按照随机数字法将RB细胞分为以下四组：对照组(细胞常规培养)；低浓度葫芦素B(葫芦素B浓度为1 μmol/l)组；中浓度葫芦素B(葫芦素B浓度为10 μmol/l)组；高浓度葫芦素B(葫芦素B浓度为100 μmol/l)，细胞生长48 h后进行后续实验。

3.RB细胞增殖率检测：按照试剂盒说明配置MTT溶液(用PBS配置，调整MTT液浓度为5 mg/ml，将PH值调至7.4)，胃癌SGC7901细胞培养于96孔板内，细胞密度为1×105/ml，PBS冲洗细胞后，加入配置好的MTT液培养4 h，弃上清，每孔加 150 μl DMSO液体，手动摇晃混匀后测定570 nm吸光度值。

4.Hoechst 33342/PI双染观察细胞凋亡：收集细胞并调整细胞密度至5×105个/ml，加入10 μlHeochst33342染液，混匀后孵育10 min，PBS冲洗2次后加入5 μl PI染液，混匀后继续室温避光放置10 min，荧光显微镜下观察，Heochst33342用波长为352 nm的氪激光激发，PI用波长为488 nm的氩离子激光激发。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡：RB细胞接种于6孔板中，0.1%胰酶(不含EDTA)消化各组细胞后制备细胞悬液。800 r/min离心5 min后弃去上清收集细胞，转移至含有300 μl缓冲液的离心管中，重悬细胞并调整细胞数为1×106/ml，分别加入5 μl Annexin-V和10 μl PI，室温下避光反应20 min后进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。

6.电镜观察细胞内结构改变：细胞经3%戊二醛固定后以PBS冲洗3次，置于1%锇酸固定液中2 h，PBS冲洗3次PBS冲洗3次后50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮依次梯度脱水，包埋后用柠檬酸铅染色10 min，双蒸水漂洗3～5次。待切片干燥后，透射电镜观察。

7.蛋白质印迹法检测RB细胞内Bax及Bcl-2的蛋白表达：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，在摇床上缓慢摇动，分别用一抗、二抗孵育，ECL化学发光法显影。

三、统计学处理

采用SPSS18.0统计学软件分析数据。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、葫芦素B抑制RB细胞增殖

MTT结果显示，对照组细胞增殖率为96.33%，不同浓度葫芦素B干预RB细胞48 h 后，其OD值均明显降低(P<0.01，图1)，RB细胞增殖率逐渐下降。

二、葫芦素B促进RB细胞凋亡及坏死

Hoechst33342染液能够穿透正常细胞的细胞膜，染色后呈弥散的低蓝光，对于凋亡细胞，Hoechst33342染液后呈亮蓝色；PI不能穿透正常细胞的胞膜，但可以穿透坏死细胞的细胞膜，荧光显微镜检测时，被PI染液染色的细胞呈现红色荧光。我们的观察结果显示，伴随葫芦素B浓度增加，凋亡及坏死细胞数量逐渐增多。

A示对照组 B示葫芦素B低浓度组 C示葫芦素B中浓度组 D示葫芦素B高浓度组

三、葫芦素B促进RB细胞凋亡

为了进一步检测葫芦素B促进RB细胞凋亡率的影响，我们采用流式细胞技术方法测定了不同组别的细胞凋亡率，实验中使用的为Annexin V-FITC/PI双染色检测试剂盒。结果显示，对照组RB细胞凋亡率为(2.57±1.43)%，随着葫芦素B作用浓度的递增，RB细胞凋亡率也呈剂量依赖性递增(17.97±3.45)%、(24.90±4.47)%、(35.40±5.43)%，图3)。

四、电镜观察葫芦素B对RB细胞内结构的影响

对照组RB细胞细胞核结构清晰易辨。葫芦素B干预后RB细胞胞浆浓缩，细胞核染色质凝结聚集在核膜周边，呈新月状或环状小体改变，葫芦素B高浓度组细胞浆肿胀明显，可以观察到空泡结构，部分细胞细胞膜不完整，内质网变疏松并与胞膜融合形成空泡(图4)。

五、葫芦素B促进线粒体凋亡信号通路

葫芦素B低、中、高浓度干预RB细胞后，Bax蛋白相对表达量分别下降至(65.44%±5.22)%、(86.67%±6.53)%和(107.18%±6.20)%，与对照组的蛋白相对表达量(52.25%±4.29)%比较差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组Bcl-2蛋白相对表达量为(112.10%±6.98)%，葫芦素B低、中、高浓度干预后其相对表达量分别下降至(86.43±5.83)%、(49.08±3.57)%、(27.05±3.97)%，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05，图5)。

讨 论

RB具有家族遗传倾向，是婴幼儿眼病中危害性最大的一种恶性肿瘤，易发生颅内及远处转移，常危及患儿生命[5，6]。

葫芦素B是葫芦素家族中含量最丰富的一种四环三萜类化合物，提取自葫芦科等植物，具有天然、低毒、高效及价格低廉的特征[7，8]。既往已有多项研究证实葫芦素B对肿瘤细胞生长有抑制作用。谭立君的研究结果显示，葫芦素通过阻滞卵巢癌细胞SKOV3的生长周期，抑制转录激活因子和信号转导表达促进SKOV3细胞凋亡[9]。在眼部，葫芦素B通过诱导线粒体膜去极化、细胞内ROS积累、改变相关蛋白表达、促进神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡[10]。本实验中MTT结果显示，葫芦素B浓度依赖性的抑制了RB细胞的生长。

细胞凋亡多伴有形态上的改变。Hoechst 33342/PI染色法可以直观的将细胞凋亡及坏死情况展现。本实验中，对照组细胞均为暗蓝色低荧光，葫芦素B干预RB细胞后，亮蓝色(凋亡细胞)及红色(坏死细胞)细胞逐渐增多，证实葫芦素B能够诱导RB细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI检测方法灵敏，能特异检出凋亡早期细胞。通过流式细胞技术检测细胞凋亡率我们发现，伴随葫芦素B浓度升高，RB细胞凋亡率递增。

Bax及Bcl-2均属于细胞内线粒体凋亡信号通路中的信号分子[11，12]。Western blot结果显示，葫芦素B促进凋亡信号分子Bax的表达，抑制RB细胞中抗信号分子Bcl-2的表达，进一步说明葫芦素B能够有效抑制RB细胞凋亡。

综上所述，葫芦素B通过线粒体途径抑制RB细胞活力，促进细胞凋亡。基于葫芦素B天然、低毒、高效及价格低廉的特征，有望为RB治疗提供新的药物选择。