放疗联合缺氧诱导因子-1抑制剂对荷乳腺癌小鼠治疗的作用

刘凯　王红梅

摘要：本文探讨了放疗联合缺氧诱导因子-1（HIF-1）抑制剂对荷乳腺癌小鼠肿瘤生长的影响，构建了BALB/C小鼠4T1乳腺癌模型，随机分为4组，每组4只，分别为对照组、放疗组、HIF-1抑制剂组（因使用HIF-1抑制剂为PX478，以下称PX478组）、放疗联合PX478治疗组（以下称联合组），监测4组小鼠肿瘤生长的情况并绘制生长曲线。荷乳腺癌小鼠于25天后，无菌取肿瘤组织、淋巴结及脾脏，观察免疫印迹分析HIF-1α和MMP-2蛋白含量的情况。结果发现，联合组肿瘤生长明显缩小，肿瘤组织的HIF-1α和MMP-2蛋白含量最少。由此可以看出，放疗联合缺氧诱导因子-1抑制剂可抑制荷乳腺癌小鼠肿瘤细胞的生长。

关键词：放射治疗   缺氧诱导因子   肿瘤

肿瘤已成为威胁人类死亡的重要原因，肿瘤的治疗方法成为各国学者研究的热点。免疫系统既可以引起机体抗肿瘤免疫效应，又可以诱导肿瘤细胞形成免疫耐受。免疫系统在肿瘤的发生、进展过程中发挥着双重作用，可分为三个主要阶段：免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸。放疗可以治疗肿瘤，临床上出现了一种有趣的现象，在肿瘤局部放疗时，放射野外远处转移病灶也出现了缩小，即“远位效应”。研究表明，这一现象是由放疗激活机体免疫应答引起的。放疗联合免疫治疗显著优于任何单一疗法，但对于放疗促进抗肿瘤免疫反应的具体机制还需要进一步探讨。随着肿瘤的日益长大，组织缺氧也会变得越发严重，缺氧改变了肿瘤微环境，在肿瘤的发生、发展中起到了重要作用，缺氧还改变了肿瘤微环境中重要的免疫因子。下面，笔者将着重探讨放疗联合HIF-1抑制剂PX478对荷乳腺癌小鼠肿瘤生长的影响。

一、实验方法

1.4T1乳腺癌小鼠建模

取将处在对数生长期的4T1乳腺癌细胞注入BALB/C小鼠背部接近后肢处[1ml注射器注射0.1ml（含2×105细胞）细胞悬液]。

2.治疗方法

每日观察荷瘤小鼠肿瘤的生长

情况，按照体积= ×长径×短径2

计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，待肿瘤体积≥150-300mm3后（大约7-12天）进行下一步治疗。随机将荷瘤小鼠分为4组（对照组、放疗组、PX478组、联合组），每组4只，每天给予PX478组和联合组200ul PX478灌胃，对照组和放疗组给予200ul PBS灌胃。第13天，对放疗组和联合组荷瘤小鼠进行10Gy的电离辐射放疗后，继续进行灌胃治疗，并监测肿瘤大小。

3.取肿瘤组织、脾脏和淋巴结进行数据分析

荷瘤25天，脱颈椎法处死荷瘤小鼠，无菌下收集肿瘤组织，置电子天平称重，收集脾脏、淋巴结放于5ml培养皿中。

4.肿瘤组织HIF-1α、MMP-2蛋白表达量测定

提取肿瘤组织蛋白，BCA法蛋白浓度测定，SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、免疫印迹及曝光。

5.统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（Mean±SD）显示，两组以上数据间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。统计结果值均以P<0.05作为差异，具有统计学意义。

二、结果

1.肿瘤生长

每日观察肿瘤的变化并记录生长情况，用体积公式计算出肿瘤大小，并绘制出肿瘤生长曲线，接瘤7天后，肿瘤生长至150-300 mm3，分别给予PX478和联合组灌胃治疗，第13天给予放疗和联合组10Gy放射治疗后，继续进行灌胃治疗并监测肿瘤大小。

如图1中A所示每日记录肿瘤体积，实验期间计算每组肿瘤体积平均值，其中，放疗组与PX478组肿瘤平均体积无明显差异（P=0.1894），而联合组与其余三组肿瘤平均体积的差异均存在统计学意义（P<0.05）。

图1中B为荷瘤第25天处死小鼠后剥离肿瘤的情况，可以直观地看出放疗组、PX478组、联合组的肿瘤生长明显小于对照组。

图1中C为剥离的肿瘤测重，联合组与放疗组、PX48组肿瘤重量的差异具有统计学意义（P<0.05），而且联合组与对照组肿瘤重量的差异则有显著统计学意义（P<0.01）。以上结果提示放疗联合PX478治疗可以显著地抑制荷乳腺癌小鼠肿瘤的生长。

2.PX478对肿瘤组织中HIF-1α、MMP-2蛋白表达影响

我们用Western Blot法检测使用PX478和放疗后肿瘤组织中HIF-1α、MMP-2表达的情况，如图2所示。结果显示，联合组与PX478组的HIF-1α蛋白水平无明显差异（P=0.1791），联合组与放疗组的HIF-1α蛋白水平的差异具有统计学意义（P<0.05），而且联合组与对照组的HIF-1α蛋白水平的差异有显著统计学意义（P<0.01）。由此可见，PX478联合放疗可以导致肿瘤的HIF-1α蛋白水平降低，从而引起的MMP-2蛋白也出现低表达的情况。

三、讨论

放疗成为肿瘤治疗的重要方法之一，1895年11月，伦琴首次发现了X射线。1896年1月，格鲁比就用X射线治疗了第一例乳腺癌的患者，已有100多年的历史。研究人员发现放疗不同剂量，分割模式对不同肿瘤的治疗效果也不一样。放疗通过促进HMGB-1释放，再刺激抗原呈递细胞（APC）活化和成熟，促使T细胞的活化，使肿瘤容易被机体免疫识别而被清除。

肿瘤生长需要大量营养，组织缺氧是很多分子信号通路的潜在驱动子，这些驱动子使肿瘤细胞得以存活，并在微环境中生长，使得肿瘤细胞放射敏感度降低。克拉克的团队于2014年证实在通过高氧预处理多形性成神经胶质瘤后放疗效果更好。张玉春的团队通过较低剂量的照射，抑制低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）等mRNA的表达，改善裸小鼠荷SKOV-3卵巢瘤的缺氧状况，提高放射敏感性。利用PX478抑制小鼠体内缺氧的微环境，提高放疗的敏感度能否提高肿瘤的治疗效果是一个值得尝试的课题。

四、结语

本研究通过构建小鼠4T1乳腺癌模型，用放疗联合PX478可以促进小鼠机体产生抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤生长。与此同时，探索放疗的最佳剂量及分割模式以及联合最优剂量的免疫抑制劑对不同肿瘤的治疗效果是一项烦琐而富有挑战性的工作。

参考文献：

[1]胥芸芸，洪梅，李桂香.放疗对机体抗肿瘤免疫效应机制的影响[J].现代肿瘤医学，2016（24）.

（作者单位：刘凯  南昌市卫生学校;王红梅  南昌大学基础医学院）