圣草酚促进miR-128缓解金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤

陈鹏举，史迎迎，赵庆枫，张光辉*

(1.河南省现代中兽医研究院，河南 郑州 450002；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；3.周口职业技术学院，河南 周口 466001)

乳腺炎是乳腺组织受病原微生物等感染和损伤所引起的炎性反应，是奶牛泌乳期间常发的疾病之一，会引起奶牛产奶量下降、乳汁质量不佳及死淘率增加等，严重危害奶牛养殖业的经济效益。金黄色葡萄球菌(金葡菌)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一[1-2]。金葡菌一旦在牛群中传播，会引起奶牛包括慢性乳腺炎在内的多种疾病，且很难根治。因此，准确的诊断及治疗乳腺炎对奶牛养殖业具有重大的经济价值。

microRNAs (miRNAs)是一类约由22个核苷酸分子组成的小型非编码RNA，在多种物种中广泛存在。miRNA通过与其靶mRNA相互作用，进而参与到mRNA转录后调节的过程中[3-5]。随着对miRNA研究的逐渐深入，发现其参与到多种疾病发生发展的过程中，并起到了较好的调控作用。有研究表明，miRNA在炎症性疾病中发挥着重要的作用，如类风湿关节炎[6]、肾脏炎[7]和心肌炎[8]等。圣草酚是一种多酚黄酮类化合物，在蔬菜和水果中广泛存在[9-10]。圣草酚在细胞炎症和氧化等方面研究广泛，其不仅能够治疗疾病，还能对疾病起到一定的预防作用[11-12]。越来越多的研究表明，药物与miRNA之间的互作可以起到对疾病的治疗作用。姜黄素通过提高miR-122的表达从而起到抗肿瘤的作用[13]，丹参酮ⅡA通过下调miR-1的表达对缺血心肌具有保护作用[14]。但是，圣草酚与miRNA之间是否具有互作机制尚未见报道，还需要进一步探讨。

miRNA-128(miR-128)是众多miRNA家族中的一员，参与到动脉粥样硬化和结直肠癌等疾病的发生发展过程中[15-16]。髓样分化因子(MyD88)是Toll信号通路中的一个关键因子，在炎症等疾病中起到信息传递的作用[17-18]，但miR-128与MyD88在奶牛乳腺炎中的作用机制尚不清楚。此外，在炎性反应中，圣草酚是否与miR-128共同作用依然未知，需要进一步探讨。因此，本试验旨在探究圣草酚与miR-128在奶牛乳腺炎疾病发生发展过程中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 金葡菌的培养金葡菌 (ATCC 25923)在37℃、200 r/min的摇床上进行培养，保存于含有25%甘油的LB培养基中，-80℃冻存。将过夜培养的金葡菌重新接种到新鲜LB培养基中，生长至对数增长期，用离心法收集细菌，清洗并在生理盐水中以适合的浓度重悬，以获得最终接种物的密度。菌落形成单位(CFU)的接种量经连续稀释和平板计数法确认。

1.2 乳腺上皮细胞的培养奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5% CO2培养箱中进行培养。

1.3 CCK-8测试为检测灭活的金葡菌和圣草酚(B21160，上海源叶生物科技有限公司)是否影响细胞活力，采用CCK-8检测试剂盒(Beyotime)检测MAC-T细胞活力。于37℃、0.2%甲醛灭活金葡菌24～48 h，以保持金葡菌的完整形态，防止细菌生长而不产生细胞毒性。细胞接种于96孔板，密度约为4.5×104细胞/孔，于接种后0，6，12，24 h分别用金葡菌(MOI=10)刺激细胞，圣草酚分别用5，10，20 μmol/L 的量处理细胞，用新培养基替代孔内旧培养基，并加入CCK-8试剂。继续培养4 h，用酶标仪(Thermo scientific Multiskan MK3,USA)测量D450 nm值。

1.4 miR-128模拟物及抑制剂的转染miR-128模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)由上海吉玛制药技术有限公司合成。按照转染试剂说明书，将miR-128 mimics、inhibitor和其各自的阴性对照mimic NC和inhibitor NC用转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen)转染进MAC-T细胞中，在转染4～6 h后更换培养液，继续培养12 h后收集样品。

1.5 MAC-T细胞RNA的提取及反转录用Trizol(Invitrogen)提取MAC-T细胞中总的RNA，然后用反转录试剂盒(诺唯赞，南京)通过茎环法进行miR-128的反转录。

1.6 实时荧光定量PCR用SYBR Green染料法进行miR-128及TNF-α、IL-1β和IL-6的测定，通过公式2-ΔΔCt计算其各自的表达量，用于定量的基因引物序列如表1所示。

表1 炎性细胞因子引物序列

1.7 双荧光素酶试验通过生物信息学网站分析得知MyD88是miR-128的预测靶基因，将MyD88 mRNA 3′UTR 区域的野生型(WT-3′UTR)和突变型(MuT-3′UTR)扩增片段分别连接到psi-CHECK2载体上，使用LipofectamineTM2000将野生型及突变型载体和miR-128 mimics 或inhibitor及阴性对照共同转染至293T细胞，24 h后裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因系统评估报告基因活性。

1.8 ELISA试验按照ELISA试剂盒(Bio-Swamp)说明书方法将收集的细胞上清液用于定量TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平的测定。使用酶标仪测量D450 nm值，并通过线性标准曲线计算TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

1.9 数据分析通过GraphPad Prism 6.0进行数据的计算和处理，各组数据以x±sx表示，并用t检验、Two-way ANOVA进行各组数据之间差异性的分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 金葡菌和圣草酚的细胞毒性检验为了探讨miR-128在MAC-T细胞中的表达变化，首先检测圣草酚和灭活的金葡菌是否具有细胞毒性作用，通过用CCK-8试剂盒检测MAC-T细胞，结果表明，在MOI为10时，灭活的金葡菌对MAC-T细胞的存活率没有影响，圣草酚在3种剂量下也无明显的细胞毒性作用(图1)。

图1 金葡菌和圣草酚对MAC-T细胞活力的影响 A.金葡菌对MAC-T细胞活力的影响;B.圣草酚对MAC-T细胞活力的影响

2.2 金葡菌和圣草酚对miR-128表达水平的影响为了检测miR-128在炎性反应中表达水平的变化，用金葡菌刺激MAC-T细胞，结果发现，miR-128的表达水平随时间变化逐渐降低，且在12 h降到最低。因此，选取12 h这一刺激节点，通过运用圣草酚，结果表明圣草酚会促进在金葡菌刺激下miR-128的表达(图2)。

图2 金葡菌和圣草酚对miR-128表达水平的影响 A.金葡菌对miR-128表达水平的影响;B.圣草酚对miR-128表达水平的影响。*表示差异显著。下同

2.3 圣草酚对miR-128转染下的炎性因子表达水平的影响为了进一步验证miR-128对炎症因子表达的影响，使用miR-128 mimics或miR-128inhibitor转染MAC-T细胞,结果发现，转染mimics和inhibitor后，miR-128的表达水平稳定，表明miR-128的转染效率稳定。此外，miR-128 mimics组显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平，而miR-128 inhibitor则显著提高TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。在使用圣草酚进一步处理之后，圣草酚会显著降低mimics转染下TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平，同时也显著升高inhibitor转染下TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平(图3)。

图3 圣草酚对miR-128转染下的炎性因子表达水平的影响 A,B.miR-128分别在mimics和inhibitor转染后的表达水平；C～E.圣草酚对miR-128 mimics转染下TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响；F～H.圣草酚对miR-128 inhibitor转染下TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响

2.4 双荧光素酶试验验证结果为了确认miR-128与MyD88之间的靶向关系，通过双荧光素酶试验进行验证。结果显示，在WT-3′UTR中，miR-128 mimics组的荧光素酶活性显著高于mimic NC组，而在MuT-3′UTR中，miR-128 mimics组和mimic NC组之间无显著性差异；由此可知，MyD88是miR-128的一个靶基因(图4)。

图4 miR-128通过直接靶向3′UTR调控MyD88的表达

2.5 圣草酚对si-MyD88转染下的炎性因子表达水平的影响通过干扰MyD88，探究MyD88在炎症中的作用机制。结果显示，敲低MyD88后，TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表达水平会显著升高，且在圣草酚处理之后，TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表达水平会进一步降低(图5)。

图5 圣草酚对si-MyD88转染下炎性因子表达水平的影响

3 讨论

奶牛乳腺疾病是关乎奶牛养殖业安危的关键问题，而在日常的养殖及挤奶环境下，乳腺疾病的发生同样不可避免。金葡菌是引起奶牛疾病常见的一种病原菌，常会引起乳腺炎和子宫内膜炎[19-20]，奶牛一旦感染就会很难根治。因此，有效预防及治疗奶牛乳腺炎显得至关重要。

近年来，人们对miRNA的研究日益增多，miRNA参与到多种疾病的治疗之中，其中在肿瘤方面的研究较为广泛。miR-128在肿瘤方面的研究也较多，有报道表明，miR-128会通过HTERT调控乳腺肿瘤启动细胞的自我更新[21]。此外，miR-128还能抑制肿瘤的生长和血管的生成[22]。本试验首先探究了miR-128对乳腺炎的治疗作用，结果显示，miR-128会抑制相关炎性因子的表达。在奶牛乳腺炎治疗方面，miRNA是一种新型的方法。圣草酚属于一种天然二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化及神经保护等方面的作用[23-26]。有研究表明，圣草酚会参与NF-κB这一经典炎性通路的调节，在炎性反应中发挥着重要的作用[27]。本试验将圣草酚介入到miR-128的调控中，结果发现圣草酚会促进miR-128的表达，且会进一步增强miR-128对炎性反应的抑制作用。

miRNAs通过阻断翻译或诱导靶基因的降解，为基因表达的转录后调控提供了一条新的途径。这一过程被认为是miRNAs组织和细胞类型特异性表达的主要控制机制。miRNAs主要通过与其靶mRNA作用，进而发挥其调控作用。尽管生物信息学网站预测了许多miR-128的靶基因，但其中某些靶基因可能与miR-128之间没有作用。到目前为止，已经通过试验验证了包括蛋白受体、细胞外基质糖蛋白和激酶在内的许多基因是miR-128的靶标[28-30]。在本试验中，通过TargetScan、miRBase和miRWalk网站预测到MyD88是miR-128的一个靶基因。双荧光素酶试验结果发现，miR-128 WT-3′UTR的荧光素酶活性显著降低。这些数据表明，MyD88是金葡菌刺激后miR-128的靶点。

MyD88在IL-1刺激后被募集到IL-1受体复合物中，与IRAK结合后会介导IRAK与受体的结合[31]。此外，MyD88下游与NF-κB信号通路相关联，在炎症相关疾病中作用重大。MyD88的抑制也进一步导致下游促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达受到抑制，缓解炎性反应[32]，这与本试验结果相一致。此外，圣草酚的添加进一步增强MyD88的干扰所引起的TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平的抑制作用。

综上所述，本试验证明miR-128通过抑制MyD88来抑制金葡菌诱导的MAC-T细胞的炎性反应，且圣草酚进一步增强miR-128对炎性反应的抑制作用。miR-128介导的转录后调控可能参与了金葡菌诱导MAC-T细胞炎性反应的微调。虽然本试验发现圣草酚增强miR-128的表达，但其中的作用机制还不清楚，可能与miR-128的靶基因有关，有待于进一步的研究。