奶牛子宫内膜炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

王宁宁，王丽娟，李 芬,2，徐正豪，李勤凡,2*

(1.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

奶牛子宫内膜炎是由于病原微生物感染等因素引起子宫内膜发生炎症反应，从而造成子宫内膜层出现病理变化的一种疾病。该病可导致患牛屡配不孕甚至死亡[1]，对奶牛生殖系统带来长期不可逆转的影响[2]，由此造成的泌乳量下降、饲养成本增加甚至淘汰率升高等问题给奶牛场带来了严重的经济损失[3]。

子宫内膜炎主要由病原微生物感染引起，产后初期一些致病菌通过松弛的阴门、阴道及扩张的子宫颈进入子宫，并利用子宫内适宜的营养物质和温度条件进行增殖。当子宫无法通过自净过程排除致病菌时，会导致子宫内膜炎的发生[4]。其致病菌多呈混合感染，种类繁多，各地细菌种类差异明显，主要致病菌以肠杆菌科、葡萄球菌属、链球菌属、化脓隐秘杆菌和芽孢杆菌科为主。传统的细菌培养方法费时费力，不能满足临床上诊断疾病的需要，多重PCR检测方法简单、快速且灵敏度高，便于临床诊断中使用。本试验针对奶牛子宫内膜炎常见致病性大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、乳房链球菌和绿脓杆菌，建立多重PCR检测方法，以期为奶牛子宫内膜炎的快速诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器PTC0200 PCR扩增仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；NanoDrop one核酸蛋白测定仪购自美国Thermo Fisher公司；TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye(RR901A)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 菌株与临床样品所用菌株及临床样品均由西北农林科技大学动物医学院生物毒素实验室提供。

1.3 基因组模板的制备按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取6种目标菌(大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、奇异变形杆菌和绿脓杆菌)及停乳链球菌、松鼠葡萄球菌、浅绿气球菌和蜡样芽胞杆菌的基因组并进行浓度检测。

1.4 引物设计根据致病性大肠杆菌的ycjM基因[5]、化脓隐秘杆菌的溶血素plo基因[6](登录号：KJ150329.1)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc[7](登录号：CP029087.1)、乳房链球菌的纤溶酶原激酶pauA基因[8](登录号：AJ012548.1)、绿脓杆菌的O抗原乙酰基转移酶基因[9](登录号：CP023255.1)、奇异变形杆菌的尿素酶合成的正向调节因子R基因[10](ureR，登录号：Z18752.1)设计特异性引物，引物序列见表1。利用Primer 5.0软件进行引物设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 引物的鉴定使用6种目标菌的特异性引物和基础模板进行单一PCR扩增，20 μL反应体系：上、下游引物终浓度各250 nmol/L，2×TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye(RR901A)10 μL，DNA模板终质量浓度1 mg/L，加ddH2O至20 μL。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，共30个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将测序结果与GenBank中的标准序列进行比对。

使用设计的引物对6种目标菌及停乳链球菌、松鼠葡萄球菌、浅绿气球菌和蜡样芽胞杆菌共10种细菌的混合基因组进行PCR扩增，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 引物浓度梯度测试将各个单一PCR体系中的引物进行梯度稀释，设置终浓度为2.50×10-3，1.25×10-2，2.50×10-2，1.25×10-1，2.50×10-1，1.25 μmol/L 的6个梯度，确定各引物反应浓度范围。

1.7 多重PCR方法的建立根据实际综合6种致病菌单一PCR的引物浓度，设计多重PCR反应，并对多重PCR进行退火温度梯度测试。将反应程序的退火温度设置50，52，54，56，58，60，62℃ 7个梯度进行最适退火温度的确定。

1.8 多重PCR特异性试验在多重PCR反应体系中随机加入不同种类的目的模板(终质量浓度1 mg/L)以检测多重PCR的稳定性和特异性。

1.9 多重PCR敏感性试验将体系中的模板梯度稀释，设置终质量浓度4×103，4×102，4×101，4，4×10-1，4×10-2，4×10-3，4×10-4μg/L 8个梯度进行最低模板质量浓度测试。

1.10 多重PCR检测方法的应用选取11个临床样品，在4 mL无菌离心管中加入2～3 mL含10%绵羊血清的LB液体培养基，加入至少100 μL患病奶牛的子宫内容物，过夜培养。对培养物进行基因组提取，进行多重PCR检测。将检测结果与传统细菌分离鉴定结果进行比较，测试多重PCR检测方法的效果。

2 结果

2.1 引物鉴定将测序结果进行比对，各引物PCR测序结果均与目的基因同源性达99%以上。使用混合菌模板进行PCR，结果表明各单一PCR扩增结果良好，均在相应位置扩增出条带，未见非特异性条带出现(图1)；结果证明本试验设计的引物特异性良好。

图1 单一PCR引物的特异性检测 M.DL1000 DNA Marker；1.乳房链球菌引物；2.奇异变形杆菌引物；3.绿脓杆菌引物；4.大肠杆菌引物；5.金黄色葡萄球菌引物；6.化脓隐秘杆菌引物；7.阴性对照

2.2 单一PCR引物浓度测试对单一PCR反应体系进行引物浓度梯度测试，结果表明不同引物其最适终浓度范围各有不同。其中乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的适宜引物终浓度为2.50×10-2～1.25 μmol/L；奇异变形杆菌为1.25×10-2～1.25 μmol/L；大肠杆菌为1.25×10-2～2.50×10-1μmol/L；化脓隐秘杆菌为1.25×10-2～ 1.25 μmol/L；绿脓杆菌为2.50×10-2～2.50×10-1μmol/L(图2)。

图2 单一PCR引物浓度梯度(2.50×10-3，1.25×10-2，2.50×10-2，1.25×10-1，2.50×10-1，1.25 μmol/L和阴性对照) M.DL1000 DNA Marker；1～7.乳房链球菌；8～14.奇异变形杆菌；15～21.大肠杆菌；22～28.化脓隐秘杆菌；29～35.金黄色葡萄球菌；36～42.绿脓杆菌

2.3 多重PCR检测方法的建立对多重PCR的各个引物比例及退火温度进行调整，结果显示,当退火温度为58℃(图3)，循环次数为30次，各个引物终浓度分别为乳房链球菌0.30 μmol/L、奇异变形杆菌0.24 μmol/L、金黄色葡萄球菌0.10 μmol/L、大肠杆菌0.15 μmol/L、化脓隐秘杆菌0.14 μmol/L、绿脓杆菌0.19 μmol/L时，6种致病菌相对应的目的条带清晰可见。

图3 多重PCR退火温度梯度测试 M.DL1000 DNA Marker；1～7.50，52，54，56，58，60，62℃

2.4 多重PCR特异性试验将6种目标菌的模板进行随机组合并测试，进行多重PCR扩增，结果均能扩增出相应大小的目的条带，且无其他非特异性条带(图4)。

图4 多重PCR检测方法的测试 M.DL1000 DNA Marker；1.化脓隐秘杆菌；2.金黄色葡萄球菌；3.大肠杆菌；4.绿脓杆菌；5.奇异变形杆菌；6.乳房链球菌；7～34.均为6种目标菌模板的随机组合；35.阴性对照

2.5 多重PCR模板敏感度测试对多重PCR检测方法进行模板敏感度测试，结果表明化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的模板最低检测质量浓度为40 μg/L，绿脓杆菌、奇异变形杆菌和乳房链球菌的模板最低检测质量浓度为4 μg/L(图5)。

图5 多重PCR模板敏感度测试 M.DL1000 DNA Marker；1～8.4×103，4×102，4×101，4，4×10-1，4×10-2，4×10-3，4×10-4 μg/L；9.阴性对照

2.6 多重PCR检测方法的应用使用多重PCR检测方法对样品DNA进行检测，结果表明,检测样品均呈现阳性反应，其中8个样品检测出大肠杆菌，5个样品检测出化脓隐秘杆菌，1个样品检测出乳房链球菌，与细菌分离结果一致，检测结果良好(图6)。

图6 多重PCR检测方法应用 M.DL1000 DNA Marker；1～11.样品；12.阳性对照；13.阴性对照

3 讨论

奶牛子宫内膜炎始终是奶牛产后主要疾病之一，其致病细菌种类繁多，难以防控。传统的细菌培养方法诊断周期过长，不能满足临床需求。而多重PCR检测方法因其简便快速的特点，已在多种致病菌检测、单种致病菌的准确鉴定、病毒检测、耐药基因和毒力基因检测等方面广泛应用。在国内，食品检测[10-11]、水源检测[12]、乳房炎致病菌检测[13-14]等多个方向均有多重PCR检测方法的报道，但在子宫内膜炎病原菌鉴定方面应用较少。

本试验建立的多重PCR检测方法，能有效检测大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、乳房链球菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌6种细菌。与王爽[15]建立的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌的3重PCR诊断方法，以及张维军[16]建立的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的3重PCR诊断方法相比，本试验建立的6重PCR诊断方法在检测细菌种类和特异性方面均有所提升，同时，引物特异性良好，较高的退火温度也使引物与模板结合特异性进一步提高，使疾病的检测流程进一步简化。在国外，近年来仅见AGHAMIRI等[6]建立了大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、坏死梭杆菌和产黑色素普菌的4重PCR诊断方法，该方法特异性良好，操作简单，但其主要致病菌种类与国内有一定差异，因此并不适合国内应用。本试验建立的6重PCR诊断方法与国内主要致病菌的分布相似度较高，同时其扩增产物条带之间差异最小为86 bp，条带间隔合理，大小清晰可辨，利于临床实际应用。

本试验建立的多重PCR检测方法可检测的最低模板终质量浓度为4～40 μg/L，略低于夏颖等[13]1 μg/L的最低模板终质量浓度，与陈亚明等[14]10 μg/L 的最低模板终质量浓度以及刘骆强等[11]0.404～46.000 μg/L的最低模板终质量浓度基本一致。与单一PCR相比，多重PCR模板敏感度显著降低，这可能与引物之间的相互作用有关；因此在进行多重PCR检测时可先对样品进行细菌培养以增加细菌量或增大样品量，以确保检测结果的准确性。