列当对肾阳虚模型大鼠血清中内分泌激素水平的影响

张 鹏，高珍珍，马晓彤，马晓宇，史晓宇，吴靖泽，杨 英

(内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

肾脏是先天之本，主生长、发育和生殖[1]，肾脏的功能在机体中具体表现为推动脏腑经络的运行,促进血液津液的循环，抵御外邪的侵犯和化生气血津液等精微物质。肾阳虚在动物临床是一种常见的证型也是多种疾病的共同证型[2]。肾阳虚与神经内分泌和免疫系统关系密切,会引起下丘脑-腺垂体-靶腺体(肾上腺、甲状腺、性腺)轴的不同环节，不同程度的功能紊乱[3-6]。

宋代《开宝本草》中记载：列当性温味甘，归肝、肾、大肠经，有补肾助阳强筋之功效，补腰肾，令人有子，去风血。列当属(Orobanchespp.)有6种药用植物被我国少数民族作为民族药应用[7-8]，常作为肉苁蓉的代用品[9]。目前多数研究采用氢化可的松建立肾阳虚大鼠模型[10-14]。本试验以蒙医常用的黄花列当(Orobanchepycnostachya)为研究对象，测定列当水煎液对肾阳虚模型大鼠内分泌紊乱的调节作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂黄花列当由内蒙古农业大学中兽医实验室提供；氢化可的松购自吉林省华牧动物保健品有限公司(批准文号：兽药字070011270)；肉苁蓉饮片购自安国市荣华本草中药材有限公司(中药饮片符合2010年版《中华人民共和国药典》)；大鼠促性腺激素释放激素(GnRH)ELISA试剂盒、大鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒、大鼠促黄体激素(LH)ELISA试剂盒、大鼠睾酮(T)ELISA试剂盒、大鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒、大鼠促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒、大鼠促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒、大鼠三碘甲状腺原氨酸(T3)ELISA试剂盒、大鼠甲状腺素(T4)ELISA试剂盒、大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)ELISA试剂盒、大鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA试剂盒、大鼠皮质酮(CORT)ELISA试剂盒均购自艾莱萨生物科技(上海)有限公司。

1.2 列当与肉苁蓉水提液的制备称取黄花列当1 000 g，加10倍量的水(即10 L)，浸泡1 h；置于自动煎药机中水煎1 h，经3次水提后，合并3次提取液，在旋转蒸发仪中浓缩至4 g/kg。肉苁蓉水煎液的制备方法同上，在旋转蒸发仪中浓缩至2 g/kg，两者均冷冻保存备用。

1.3 动物分组健康SD大鼠36只，雌雄各半，雄性体质量(250±15) g，雌性体质量(200±15) g，购自内蒙古医科大学实验动物中心(许可证号SCXK蒙2015-0001)，适应性饲养1周，期间饲喂全价饲料，自由饮水进食，室温控制在19～25℃，相对湿度为30%～70%。将36只SD大鼠随机分为6组(n=6)雌雄各半，即空白组、模型组、列当低、中、高剂量组(1.0，2.0，4.0 g/kg)和肉苁蓉组(2.0 g/kg)。

1.4 肾阳虚模型制备除空白组大鼠外，其他组均后肢肌肉注射氢化可的松25 mg/kg，1次/d，连续15 d[14]。造模结束后出现体质量下降，饮水量增加，采食量降低,皮毛色泽暗淡无光、杂乱逆立、易脱落、四肢末端及耳尖发白、精神萎靡、扎堆、拱肩缩背、蜷缩、小便清长、便溏等现象时认为肾阳虚模型建模成功[15-18]。建模成功后，各给药组灌服相应药物，对照组和模型组灌服相同剂量蒸馏水，连续30 d。

1.5 一般情况观察试验期间每天观察1次动物脱毛、竖毛、蜷缩程度、精神状态的变化。每隔7 d测定并记录各组大鼠体质量的变化。

1.6 血清中激素的检测试验31 d大鼠心脏采血，分离血清，-20℃保存。采用ELISA方法按照试剂盒说明书进行操作，测定各组血清样品中GnRH、FSH、LH、T、E2、TRH、TSH、T3、T4、CRH、ACTH、CORT的含量。

1.7 数据处理试验数据用SPSS 22.0中的One-Way ANOVA程序进行单因素方差分析，Dunkan氏法进行多重比较，试验结果以x±s表示，用P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 一般状态观察空白组大鼠在整个试验过程中均无明显异常表现；其他各组大鼠肾阳虚症状明显，肌肉注射氢化可的松14 d后出现脱毛、毛发粗糙、黯淡无光、活动减少、体形消瘦、身体蜷缩、四肢末端及耳尖发白、扎堆、精神萎靡、反应迟钝等肉眼可见的情况。模型组在停止造模之后，随着时间的增加肾阳虚症状有一定减轻。给药28 d后，列当低、中、高剂量组和肉苁蓉组大鼠毛发较之前顺滑浓密，活动量增加，蜷缩扎堆的现象减少，四肢末端与耳尖颜色恢复正常，肾阳虚症状较此时的模型组有较大好转。

2.2 体质量分析由表1可见，与空白组比较，给药前的各组雌性大鼠体质量显著降低(P<0.05)；给药7，14，21，28 d后，与模型组比较，各给药组均无明显差异(P>0.05)。

表1 对雌性大鼠体质量的影响(x±s,n=3) g

由表2可见，与空白组比较，给药前的各组雄性大鼠体质量显著降低(P<0.05)；给药7 d后与模型组相比，各给药组均无显著差异(P>0.05)；给药14 d 后与模型组相比，肉苁蓉组体质量显著性增加(P<0.05)，其他给药组无显著性差异(P>0.05)；给药21 d后与模型组相比，肉苁蓉组体质量显著增加(P<0.05)，其他给药组无显著性差异(P>0.05)；给药28 d后，与模型组比较，各给药组体质量均显著性增加(P<0.05)。

表2 对雄性大鼠体质量的影响(x±s,n=3) g

2.3 对大鼠血清GnRH、FSH、LH、T、E2水平的影响由表3可见，与空白组相比，模型组雌鼠血清中的GnRH和E2显著降低(P<0.05)，FSH、LH、T显著上升(P<0.05)。与模型组比较，各给药组均能显著提高肾阳虚雌性大鼠血清中的GnRH和E2(P<0.05)，降低血清中的FSH、LH、T(P<0.05)。中剂量组与肉苁蓉组之间的各项指标均无显著性差异(P>0.05)。随着列当水提液浓度的增加，各给药组血清中GnRH和E2也随之增加，FSH、LH、T降低，有明显的剂量依赖性，高剂量组与空白组各项指标均无显著性差异(P>0.05)。

表3 雌鼠血清中GnRH、FSH、LH、T、E2含量(x±s,n=3)

由表4可见，与空白组相比，模型组雄鼠血清中GnRH显著降低(P<0.05)，FSH、LH和T显著性升高(P<0.05)。中剂量组与肉苁蓉之间的各项指标差异不显著(P>0.05)。随着列当水提液浓度的增加，各给药组血清中GnRH和T也随之升高，FSH、LH、E2降低。与模型组相比，高剂量组血清中GnRH和T显著性上升(P<0.05)，FSH、LH、E2显著性降低(P<0.05)，与空白相比各项指标均差异不显著(P>0.05)。

表4 雄鼠血清中GnRH、FSH、LH、T、E2含量(x±s,n=3)

2.4 对大鼠血清TRH、TSH、T3、T4水平的影响由表5,6可见，与空白组相比，模型组血清中TRH、T3、T4显著性降低(P<0.05)，血清中TSH的含量显著性上升(P<0.05)。与肉苁蓉组相比，中剂量组血清中T4的含量显著性上升(P<0.05)，其他指标与肉苁蓉组无明显差异(P>0.05)。与模型组相比，高剂量组血清中TRH、T3、T4显著上升(P<0.05)，TSH显著降低(P<0.05)。与空白组相比，高剂量组血清中TRH、TSH、T3、T4均无显著性差异(P>0.05)。

表5 雌鼠血清中TRH、TSH、T3、T4含量(x±s,n=3)

表6 雄鼠血清中TRH、TSH、T3、T4含量(x±s,n=3)

2.5 对大鼠血清CRH、ACTH、CORT水平的影响由表7,8可见,与空白组相比，模型组大鼠血清中的CRH、ACTH、CORT显著降低(P<0.05)。与肉苁蓉组相比，中剂量组血清中CRH、ACTH、CORT无明显差异(P>0.05)。与模型组相比，高剂量组CRH、ACTH、CORT显著上升(P<0.05)。与空白组相比，高剂量组血清中CRH、ACTH、CORT均无显著性差异(P>0.05)。

表7 雌鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量(x±s,n=3)

表8 雄鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量(x±s,n=3)

3 讨论

中医认为“有诸内者，必形诸外”，通过症状和体征，可以“司外揣内”和“审证求因”，从而对疾病进行辨证论治[13]。肾阳虚证是对肾阳虚衰、温煦失职、气化失权所产生证候的高度概括。肾为命门之火，是人体阳气之根本，与生长发育和生殖关系密切。若肾阳虚损，则可导致虚寒衰弱诸证，引发动物代谢器官、免疫器官、生殖器官等出现病理变化，造成功能紊乱[19-21]。

研究表明[6]，肾阳功能与神经内分泌免疫系统密切相关，而下丘脑-垂体-靶腺轴正常机能的发挥是机体内分泌系统动态稳衡的关键。下丘脑分泌GnRH、CRH和TRH调节腺垂体FSH、LH、ACT-H、TSH的释放，其中FSH和LH调节T和E2的分泌，ACTH调节CORT的分泌，TSH调节T3和T4的分泌。T、E2、CORT、T3、T4对垂体及下丘脑存在负反馈调节机制。下丘脑、垂体、靶腺在功能上联系紧密和互相影响，构成了下丘脑-垂体-靶腺轴[22]。肾阳虚通常可引起性腺轴、甲状腺轴、肾上腺轴激素分泌异常[1]。有研究表明肾阳虚大鼠血清中GnRH水平降低，LH、FSH水平升高，在雄性动物中T降低E2升高,雌性反之[22-24]。成雅等[25]和娄勇军等[26]研究发现肾阳虚可使反映下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能的CRH、ACTH、CORT下降。翟旭峰等[27]研究发现肾阳虚大鼠血清中TRH、T3、T4下降而TSH上升。血清中各个激素的含量与机体内分泌系统功能关系密切，故本试验检测了GnRH、CRH、TRH、FSH、LH、ACTH、TSH、T、E2、CORT共9项指标来反映机体的内分泌功能。

本试验结果显示，与空白组比较，模型组雄鼠体内T降低，E2、FSH、LH增高，GnRH分泌降低；模型组雌鼠体内T升高，E2降低，结果与模型组雄鼠相似，FSH、LH增高，GnRH含量降低；模型组雄鼠、雌鼠血液中TRH、T3、T4含量均降低，TSH含量升高；模型组雄鼠、雌鼠血液中CRH、ACTH、CORT含量均降低。提示氢化可的松所致肾阳虚模型大鼠的下丘脑-垂体靶腺轴下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)、下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT)、HPA)均有不同程度的紊乱，表明肾阳虚大鼠模型成功建立。

在灌服列当水煎液之后肾阳虚大鼠血清中各项激素水平均有一定程度的恢复，在一定程度上呈现剂量依赖性，其中高剂量组血清中的GnRH、FSH、LH、T、E2、TRH、TSH、T3、T4、CRH、ACTH、CORT水平与空白组已无明显差异。从试验结果来看，列当对肾阳虚模型大鼠的3个内分泌轴(HPG、HPT、HPA)均有调节作用，对其体内的内分泌紊乱具有很好的治疗效果。

列当是一种全寄生植物[28]，对我国西北地区农作物危害极大，在生产实践上通常将其作为杂草处理[29-31]；自古以来民间就有用列当代替肉苁蓉入药的方法，在一定剂量下与肉苁蓉的作用效果相似，对缓解肉苁蓉资源匮乏，保护肉苁蓉野外正常生长具有积极的意义。但现代医学并未对其开展系统深入的研究，列当的有效成分研究只局限于少数种类，临床试验研究也极其有限[9]，药用价值还未得到很好的开发。本试验为列当“变害为宝”，开发其经济价值提供了数据参考，为今后研究其有效成分、作用机制和兽药的开发提供了依据。