湖南省禽白血病病毒分子流行病学调查及env基因序列分析

吕孙良，张慧慧，胡文琴，黎洁玉，宋雅婷，肖朝庭

(湖南大学 生物学院 病原生物学与免疫学研究所，湖南 长沙 410082)

禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)属于逆转录病毒科甲型反转录病毒属，是禽白血病的病原，在禽类宿主中能够引起淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞白血病和髓细胞样白血病等疾病[1]。目前依据病毒的宿主范围、血清中和反应及外部囊膜膜蛋白的特点等分为A～K共11个亚群[2-3]，其中ALV-E为内源性ALV，致病性不强，但在感染的后期会对宿主的免疫系统造成破坏，导致其免疫力降低。而ALV-J为外源性ALV，致瘤性及感染能力均强于以ALV-A/B为代表的经典ALV亚群，是ALV目前主要的流行及致病亚群[4]。而ALV-F目前国内外的研究较少，对其致病性及其致病机制的了解甚少。我国有报道在不同时期及地区分离和鉴定出了ALV-E/J[5-7]，但对于湖南省内ALV的流行情况鲜有报道。研究表明ALV的env基因决定其宿主范围，且对于致病性的强弱也有很大的影响[8-9]。为了解湖南省内禽类养殖场中ALV的感染情况，本试验对来自21个养殖场的156份组织和血清样品进行RT-PCR检测，并对其中ALV阳性样品的env基因进行克隆测序和分析，以期为湖南省禽类养殖中ALV的防控和净化提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品收集及处理被检样品采自湖南省15个地区的21个养殖场，共156份组织/血清样品，-80℃ 保存。样品处理均在生物安全柜内进行。血液样品：真空采血后放置4℃约1 h，待凝血后4 400 r/min离心20 min，取上清备用。组织样品：取约0.1 mg 的肝脏、脾脏等组织，加入无菌无酶的细胞培养基(DMEM)0.8 mL，研磨后4℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清备用。

1.2 主要试剂病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶购自Thermo Fisher公司；T4DNA连接酶、pMD19-T载体购自TaKaRa公司；感受态细胞、核酸Marker购自擎科生物技术有限公司。

1.3 引物设计及合成从GenBank下载了52条ALV全基因组代表序列(包含ALV-A～ALV-J群)，利用DNAMAN进行序列比对，在序列保守区采用Primer Premier 6设计引物(设计引物采用的模板序列为HPRS103株，GenBank登录号为Z46390)，设计好的引物由擎科生物技术有限公司合成。检测引物(包括5′UTR的3′端283个碱基和Gag基因5′端32碱基)，ALV-DF:5′-TCATTTGGTGACCCCGACGTGAT-3′，ALV-DR:5′-GCGGACGA-AATCACCTTTATGACG-3′，目的片段大小为314 bp；env基因扩增引物(除5′端的18 碱基外，覆盖env基因全长)，ALV-En-DF:5′-GAGGTGACTAAGAAAGATGAGGCGAG-3′，ALV-En-DR:5′-CCATCAACCCAGGTGCACACCAAT-3′，目的片段大小为2 525 bp(不同毒株间大小有差异)。

1.4 样品的RT-PCR扩增参照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取已处理的血清及组织样品中的ALV基因组，-80℃保存备用；按反转录试剂盒说明书将病毒基因组反转录为cDNA，-20℃ 保存备用。取1 μL cDNA利用ALV-DF/ALV-DR进行PCR扩增，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。

1.5env基因的测序及分析阳性样品再取1 μL cDNA进一步用ALV-En-DF/ALV-En-DR扩增env基因，PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。将PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，4℃过夜，连接pMD19-T载体，随后转入到DH5α感受态中涂板培养，选菌液PCR阳性克隆送擎科生物有限公司测序。利用MEGA7.0、DNAMAN软件对所获得序列进行核酸和氨基酸序列分析并构建其系统发育树，采用RDP4软件对可能发生重组的序列进行重组分析。

2 结果

2.1 样品RT-PCR检测结果用检测引物ALV-DF/ALV-DR对来自15个地区(21个养殖场)的156份组织/血清样品进行检测，其中20个养殖场均检测出ALV(图1)，场阳性率为95.24%(20/21)，总体送检样品中ALV的PCR阳性率为72.44%(113/156)。初步表明ALV的感染在湖南省禽养殖场中较为严重。

图1 ALV检测引物RT-PCR扩增结果 M.DL2000 DNA Marker;1～8.送检样品的扩增产物；9.阴性对照

2.2env基因扩增与序列分析对检测出ALV的阳性样品选取部分样品用ALV-En-DF/ALV-En-DR引物扩增其env基因(图2)，测序后，通过序列比对及系统进化分析。结果显示 ALV-E的场检出率为90.48%(19/21)；ALV-J的场检出率为4.76%(1/21)；表明ALV-E在养殖场中普遍存在，只有少数养殖场感染ALV-J。

图2 ALV env基因扩增引物扩增结果 M.DL10000 DNA Marker;1～5.送检样品的扩增产物；6.阴性对照

系统进化分析结果发现，在1个野鸡养殖场的5个送检样品中检测出了1株ALV-F (XTLI18100214)，2株ALV(XTLI18100110和XTLI18100209)，因其env基因与其他ALV亚群差异较大(图3)，暂时无法归类，可能为一种新的ALV亚群。其余序列均归为内源性的ALV-E亚群，其env基因与已发表的内源性env基因核苷酸序列同源性为99.38%～99.90%。值得注意的是XTLI18100209及XTLI18100214是从同一份样品中鉴定出来，但两者env基因核苷酸序列相似度仅为58.60%，表明该养殖场存在ALV混合感染的情况。另外XXYI181104及XXYI101101也是从同一份肉鸡的样品中鉴定出来的2株ALV，但XXYI101101属于ALV-E，而XXYI181104属于ALV-J，也表明该养殖场存在ALV混合感染的情况。

图3 本试验检测出的ALV与其他ALV亚群参考株之间env基因核苷酸序列进化树分析(▲标记的ALV序列由本试验测得)

2.3env基因推导的氨基酸序列分析

2.3.1XXYI181104株env基因推导的氨基酸序列分析 本试验中XXYI181104株扩增的env基因的ORF长度为1 689 bp，编码562个氨基酸，与GenBank中其他ALV-J株相比其氨基酸同源性为87.96%～92.63%。XXYI181104株有一些独特的氨基酸突变位点，如A27T、V55A、PL110SP、T122A、T170A、S181T，其中T170A和S181T突变位于gp85基因中的高变区1(hr1)，但其余突变既不位于高变区，也不位于可变区(vr)(图4)[8]。另外A27T是由非极性氨基酸突变为极性氨基酸，而T122A、T170A由极性氨基酸突变为非极性氨基酸。这些位点的改变可能会对gp85基因编码的多肽的空间构象产生一定的影响，但是否会发生功能改变还有待进一步研究。

图4 XXYI181104株env基因推导的氨基酸部分突变位点 阴影部分指示位置为突变位点；可变区(vr)；高变区(hr)；“.”表示缺失；“-”表示相同

2.3.2XTLI18100110/209/214共3株env基因推导的氨基酸序列分析 本试验中XTLI18100110/209/214共3株所扩增的env基因的ORF长度分别为1 689，1 689，1 869 bp，编码562，562，622个氨基酸。其中XTLI18100214与ALV-F(AY608692株)的env基因推导的氨基酸同源性为88.69%，未发现有缺失或插入突变，系统进化分析中归为ALV-F亚群(图3，图5A)。

而XTLI18100110与XTLI18100209株env基因推导的氨基酸之间的同源性为96.84%，但二者与其他ALV亚群的env基因推导的氨基酸同源性仅为44.68%～58.42%(表1)，表明这2株ALV很可能是新的亚群。另外以与其同源性最高的ALV-J亚型(HPRS103)作为参考株，可以发现这2株ALV的env基因推导的氨基酸序列均有多处缺失或突变(图5B)。

表1 XTLI18100110/209/214株与其他ALV亚群参考株env基因核苷酸同源性 %

图5 XTLI18100214与ALV-F(AY608692株)(A)及XTLI18100110/209与ALV-J(Z46390株)(B)env基因推导的氨基酸比对结果 (“.”表示缺失；“-”表示相同)

2.3.3XTLI18100110/209/214株env基因的重组分析 本试验系统进化分析显示XTLI18100214株属于F型，XTLI18100110和XTLI18100209株与J型关系较近，由于重组易导致新型病毒的出现，因此利用RDP4软件对这3个序列进行了重组分析，结果显示，XTLI18100110/209这2株的env基因均有可能发生过重组，XTLI18100214株可能因为参考序列较少没有检出重组事件。根据已知的序列，XTLI18100110/209株的重组母本为ALV-J/SD13QJ02/China和AY608692 ALV-F/USA，重组位点在env基因核苷酸序列中启动子的下游+241及+1 655附近(图6)，说明重组事件发生在env基因内部。

图6 XTLI18100110/209株env基因重组分析(箭头指示可能的重组位点)

3 讨论

目前有研究表明，ALV以水平传播及垂直传播的方式在鸡群内进行传播，而垂直传播是各类ALV传染的主要途径[10]。ALV-E属于内源性ALV，致病性虽然不强，但在鸡发育的后期会导致免疫功能下降，使其患病风险上升，并会造成对其他外源性ALV的免疫耐受。有报道在某地方品种的鸡群中发现ALV-E的阳性率高达93.33%[11]，说明ALV-E在国内的鸡群中可能是普遍存在的。而ALV-J则是高致病性的外源性ALV，潜伏期较短，从数天到数周不等，主要靶向骨髓细胞，可以引起骨髓细胞瘤。在ALV-J被发现前，我国本地的鸡群可能也存在有ALV的几类经典亚群，但由于其危害较小，一直未引起重视。但ALV-J在全球范围内暴发后，我国因为引种不当，在国内各地各品种的肉鸡及蛋鸡也都相继发现了ALV-J的感染[12-13]。而近几年国内ALV-J的流行病学调查发现，ALV-J的阳性率在10%左右[14-15]，部分地区甚至高达55.2%[16]。马美哥等[17]新近发现的一起进口白羽肉种鸡禽白血病疫情的主要病原也是ALV-J。因此对于ALV-J及其他ALV亚群的流行病学调查具有重要的意义。

本试验首次对湖南省禽类养殖场ALV的感染情况进行了初步检测和调查，结果表明，各地养殖场中ALV的感染情况比较普遍，调查中的21个养殖场中有19个场检测出ALV-E，1个场检测出ALV-J，另外还在1个野鸡养殖场中检测出ALV-F及2株很可能是新亚群的ALV。此外在检测出ALV-J的样品中还发现了ALV-E，而ALV-F和新亚群ALV也是在同一样品中检测出，均说明这2个养殖场存在不同亚型ALV混合感染的情况。另外通过重组分析发现，在野鸡中检测出的XTLI18100209和XTLI18100110株很可能是由ALV-E及ALV-J重组形成的新亚群。另外，本试验对于内源性ALV的检测，虽然采用的是RT-PCR方法，但没有去除鸡基因组DNA，不能排除鸡基因组内源性E群env基因片段的扩增。

本试验首次调查了湖南省禽类养殖场ALV的感染情况，对于今后该省ALV的防控和净化具有一定参考价值。另外，首次在国内养殖的野鸡中发现的ALV-F以及属于新的ALV亚群的2株病毒的致病性及其传染给家鸡风险评估等有待进一步研究。