兔感染戊型肝炎病毒(HEV)对兔出血综合征(RHD)疫苗免疫效果的影响

金明兰,王 欢,郝心瑞,李华南,杜志威,徐莹莹,董莉莉,薛洪海,孙世梅,李 明,王悦红,金宁一

(1.吉林建筑大学 松辽流域水环境教育部重点实验室,吉林 长春 130118；2.山东大学 化学与化工学院,山东 济南 250100;3.军事医学科学院 军事兽医研究所,吉林 长春 130122)

兔出血性症(RHD)是由兔出血性综合征病毒(RHDV)引起的高度接触传染性、急性致死性传染病,其发病率和致死率都很高，给养兔业造成了极大的危害。目前使用的组织灭活疫苗可有效地预防和控制疫情的发生和流行，起到了良好的保护作用[1]。如果在未知兔感染其他疾病的情况下，接种疫苗是否会对机体的免疫效果产生一定的影响还未见报道。

戊型肝炎(hepatitis,HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis virus,HEV)引起的一种经粪-口途径传播的急性传染病，人感染HEV表现为急性黄疸型肝炎，严重危害人类健康[2-3]。HE病死率较高，与其他类型的病毒性肝炎相比呈现逐年上升趋势，且出现多种属动物感染的现象[4-5]。近年来，我国多地陆续报道野生兔、养殖兔感染HEV，并在体内分离出病毒粒子[6-8]。MENG等[9]首次从猪体内分离出HEV。蒋磊等[10]建立了HEV感染树鼩的动物模型，并对感染途径、感染剂量等进行了初步的研究。BEGUM等[11]在感染HEV的患者体内分离到1株HEV，通过同源性分析认为与其食用野猪肉内分离的HEV为同一病毒；ZHANG等[12]研究表明兔感染HEV导致肝脏损伤、在体内残留时间长。但是，国内外未见评估动物机体在感染HEV后是否影响免疫水平的研究。因此，本试验以某兔养殖场为研究对象，对未知感染HEV的兔接种RHDV疫苗，通过检测免疫前、后产生的RHDV体液免疫水平、细胞免疫水平、丙氨酸转氨酶(ALT)、HEV特异性抗体水平，为进一步探究机体感染病原体后对免疫效果影响的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料RHDV 疫苗、抗体检测试剂盒购自南京生物制品有限公司；DNA 提取试剂盒购自TIANGEN；Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DNA 回收试剂盒、感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ALT、IL-2和IL-4试剂盒购自上海江莱生物工程公司。

1.2 实验动物某养殖户饲养的新西兰大白兔2 批次，第1批次为18月龄兔80只，随机选取10只接种PBS 2 mL/只，作为阴性对照；70只接种RHDV疫苗2 mL/只，作为疫苗接种阳性对照。第2批次为5月龄兔260只，其中250只接种疫苗2 mL/只，10只接种PBS 2 mL/只，作为阴性对照。分别经皮下多点注射灭活疫苗、PBS，于免疫前、后1～ 4 周采血，每周采血1次后进行抗体检测，评估RHDV免疫效果。一免后5周进行二免，接种剂量、接种途径与一免相同。

1.3 血清样品的制备分别在免疫前、后1～4 周，每周采血1次，采集心脏血液4 mL/只，4℃放置1 h后，1 000 r/min离心10 min，分离血清，-80℃保存。

1.4 特异性抗体、ALT的检测将RHDV标准抗原4℃过夜包被ELISA板并编号。经加入封闭、免疫血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、显色溶液OPD、终止液后，测定各孔D450 nm值。所得数据以x±sx表示，并进行统计学分析。用同样方法，将分离的血清加入到96孔板中、编号，稀释血清后加入HEV标准抗原，室温放置约20 min，测定各孔D450 nm值，进行统计学分析。

按照说明书的操作方法，将浓缩液倍比稀释后加入到96孔板中，设立标准品重复、编号，依次加入封闭液、显色液、终止液后，测定各孔D450 nm值。所得数据以x±sx表示，并进行统计学分析。

1.5 分离外周血淋巴细胞取无菌抗凝血1份，加入等体积的Hank's液混匀，2 000 r/min离心10 min，收集界面上的细胞；再以1 500 r/min 离心10 min，弃上清液，加入无菌NH4Cl·Tris溶液；1 500 r/min 离心后弃上清液，加入5 mL Hank's液混匀，1 000 r/min 离心后弃上清液，制备外周血淋巴细胞悬液，加入10% RPMI-1640混匀后，用PBS液10倍稀释后进行细胞计数[13]。

1.6 T淋巴细胞转化试验将制备的淋巴细胞悬液的细胞密度调整为1×106/mL，将100 μL细胞液与等量的刀豆蛋白A(ConA)、RHDV、PBS加入96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱内孵育40 h左右，加入10 μL WST，用酶标仪进行淋巴细胞刺激指数(SI)检测。具体操作参照文献[14]方法进行。

1.7 IL-2和IFN-γ的检测在二免后10 d，分离外周血淋巴细胞，按照说明书的操作方法进行IL-2检测[15]。检测各孔的D450 nm值，进行统计学分析。以同样方法进行IFN-γ检测，进行统计学分析。

受上述工作启发，本文针对802.11n长距离链路研究了MAC层数据包的出错模式，并针对性的设计了FEC编码算法AdaCode.全面考虑了数据包丢失和部分出错的情况，将帧间编码和帧内编码相结合，能有效提高数据包的纠错能力.

1.8 HEV基因检测将兔接种疫苗后7，14 d各宰杀3只，无菌采集脏器，-20℃保存待测。参照文献[16]的方法进行HEV引物设计，按照DNA试剂盒说明书提取样品中的DNA，进行目的基因扩增、琼脂糖凝胶电泳检测。

1.9 统计分析有样本重复的试验，数据按x±s表示，并采用统计分析软件SPSS 11.0的广义线性模式(General Linear Models)的单变量分析(Univariate)模块对获得的数据进行配对t检验。

2 结果

2.1 实验动物情况第1批次兔在接种疫苗后1 d有3只兔出现精神萎靡、厌食等症状，3 d后恢复正常。第2批次兔接种RHDV疫苗后，部分动物出现精神萎靡、采食、饮水量降低、腹泻等症状，持续10 d；剖检重症兔可见肝脏肿大、出血、坏死，但未出现死亡。

2.2 特异性RHDV抗体水平的检测2个批次兔接种RHDV疫苗1周后抗体开始上升， 2～4周出现持续增长的趋势。而第2批次兔抗体水平增长幅度不高，其抗体水平略高于对照组和免疫前，远远低于以往同期免疫后产生的抗体水平。第1批次兔在整个试验期间所检测到的抗体水平显著高于第2批次(图1)。

图1 特异性RHDV抗体水平的检测结果

2.3 淋巴细胞转化试验2个批次兔在二免3周后分离外周血淋巴细胞，分别用ConA和RHDV刺激下进行淋巴细胞转化试验。由图2可见，第1批次疫苗接种组SI最高，第2批次疫苗接种组SI较低，但高于PBS对照组，差异不显著(P>0.05)。

图2 淋巴细胞转化结果

2.4 IL-2 检测免疫兔外周血中IL-2的检测结果如图3所示。第1批次接种疫苗兔血清中IL-2 含量最高，显著高于PBS对照组和第2批次兔。第2批次免疫兔的血清中IL-2含量略高于PBS对照组，但差异不显著。结果显示，接种疫苗后未能有效刺激机体分泌细胞因子，需继续监测第2批次兔IL-2水平，分析干扰因素，防止感染疫病。

图3 IL-2的检测结果

图4 IFN-γ的检测结果

2.6 ALT检测第1批次家兔在接种疫苗期间未出现显著变化，虽然接种疫苗后ALT的含量有所增加，但未达到临床判定阳性的标准。第2批次家兔在接种RHD疫苗后7 d ALT开始升高，14 d 持续上升，在28 d高达70 U/L，已达到临床判定阳性的标准(图5)。

图5 接种疫苗后ALT的变化结果

2.7 HEV抗体检测第1批次兔在整个检测期间未检测到HEV抗体，与接种PBS组的抗体水平相同；而第2批次兔在疫苗接种7，14，21，28 d后，HEV抗体在7 d升高，在14 d开始下降，在28 d下降明显(图6)。

图6 HEV抗体水平的检测结果

2.8 HEV在动物体内残留的检测第2批次饲养家兔在接种RHDV后7，14 d，在肝脏中检测到HEV的基因，而21 d未检测到病毒的基因。由于HEV缺乏有效的细胞培养系统，对HEV鉴定只能通过基因检测的方法进行。第1批次饲养家兔在接种RHDV后7，14，21 d均未检测到病毒的基因。研究表明，HEV在兔肝脏中含量最高，如果在肝脏中未检测到病毒基因，推测在兔体内未残留病毒基因。因此，为减少经济损失，在接种疫苗28 d后，未继续进行动物体内HEV基因检测，默认为HEV在动物体内残留结果为肝脏组织残留结果。

3 讨论

为有效地预防和控制动物疫病的传播及流行，临床上常采用接种疫苗的方法，诱导机体产生免疫反应，保护机体健康[17]。RHDV是我国最早研制的疫苗，在国内养殖场得到广泛应用，临床效果十分显著[18]。但是，在机体受到外界病原体、应激反应、噪声、高温等因素干扰时，其对机体的神经系统、免疫系统、生殖系统、血液系统等的功能会造成不同程度的影响。因此，在接种疫苗后定期监测抗体水平有利于预防疾病和筛选干扰因素。本试验通过监测细胞免疫水平、体液免疫水平，发现接种疫苗后抗体产生的水平不高，结合临床症状，推断机体可能受到病原体的干扰所致，而开展了HEV检测。

HEV可感染多种动物，且多数动物呈现亚临床症状，是一种人兽共患病原体[19]。GENG等[20]研究表明，猪是HEV感染率最高的动物，其抗体阳性率高达100%，且MENG等[21]首次从猪体内分离到HEV，认为猪携带HEV是其他动物感染的主要来源。由于猪携带HEV是一种隐性感染，其携带HEV传播给人和其他动物的风险远高于人群内部传播。ZHAO等[22]在甘肃省某兔养殖场中检测出HEV抗体阳性率较高。有研究表明[23]，在家兔、野兔中均分离出HEV，检测HEV抗体阳性率较高，证明兔可能是一种新的HEV易感动物宿主。因此，预防和控制兔疫病应密切关注HEV感染所带来的巨大威胁。

本试验中，第2批次兔接种RHDV疫苗后抗体产生的水平不高，显著低于第1批次兔产生的抗体水平，但是仍高于疫苗接种前和PBS对照组的水平，证明机体只是受到某些因素的干扰。因此，结合临床症状、剖检变化，进行了细胞免疫水平、HEV抗体、病毒基因检测。结果显示，兔体HEV抗体阳性；ALT水平高于正常指标；体内检测到HEV病毒基因，表明机体受到HEV感染。动物体内的IL-2和IFN-γ 均较低，再次表明兔感染HEV后在一定程度上影响动物体液免疫和细胞免疫效果。机体在受到外界干扰时，干扰因素的类型、强度、季节、动物种类、动物日龄等对机体生殖功能、免疫功能等的影响也存在差别。HUANG等[24]的研究结果表明，HEV毒株来源、基因型、病毒毒力、接种途径、宿主种类、宿主年龄均是疫病感染及流行的主要原因。MENG等[25]分别将3型人HEV和 3型猪HEV接种SPF猪，结果显示3型人HEV导致SPF猪出现厌食、体温升高等症状，肝脏损伤较为严重，表明不同动物、不同基因型HEV、相同基因型的不同毒株对动物机体感染力也存在较大差异。

本试验中，第2批次兔受到HEV的感染，对RHDV的细胞免疫和体液免疫造成一定的影响，但动物未表现出明显的临床症状，更未出现大批死亡，可能与感染HEV毒力、毒株等因素有关。