牦牛肺动脉平滑肌细胞的分离培养与鉴定

赵紫涵，何俊峰，潘阳阳，张 倩

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

青藏高原的自然环境特征为低温寒冷、高海拔低氧以及太阳辐射强烈。其高海拔低氧环境，会造成平原动物进入高原地区后易引发高山病，即肺动脉高压和右心室肥厚，其结构上的变化表现为肺动脉中膜肌层显著增厚及血管重塑[1-2]。

生活在青藏高原地区的牦牛(Bosgrunniens)，经过长期的自然选择，对高原低氧环境的适应已获得了稳定遗传[3]，不会发生高山病。但不同年龄牦牛的肺动脉中膜仍厚于较低海拔地区动物。随着年龄的增长，牦牛肺脏逐渐适应了高原低氧的环境，其肺动脉中膜厚度逐渐降低[4]。以往对牦牛肺脏的适应性研究，主要针对牦牛肺脏的局部解剖和组织学结构特点[5-6]，然而有关牦牛肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASM-Cs)对低氧的适应机制和过程尚不明确，PASMCs的体外分离和培养方面未见报道。为了研究PASMCs对低氧环境的适应机制，本试验将采用2种不同方法对牦牛PASMCs进行分离培养及鉴定，为后续牦牛PASMCs的进一步研究建立细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂肺动脉取材于健康雄性2～3岁牦牛(青海省西宁屠宰场)。DMEM/F12基础培养基(12400-016)、胎牛血清FBS(10099-141)、青霉素和链霉素(15140122)及胰蛋白酶(T4799)购自Sigma公司；磷酸盐缓冲液PBS(14190144)购自Gibco公司；0.4%台盼蓝购自索莱宝公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自博士德生物公司；二甲基亚砜( DMSO)购自Sigma公司；兔源性α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)多克隆抗体购自碧云天公司；钙调节蛋白(calponin)多克隆抗体购自博奥森公司；FITC标记山羊抗兔IgG购自全式金公司；DAPI购自北京酷来博公司。

1.2 心肺组织及肺动脉的采集挑选牦牛的肺动脉段，无菌操作取出整个心肺组织，置于加有双抗的生理盐水中，装入冰盒，及时运回实验室。

将心肺组织用加有双抗的生理盐水冲洗3遍后，用组织镊和剪刀剪去食管、主支气管、主动脉弓以及结缔组织。用加有双抗的生理盐水冲洗2遍，将心肺组织加入适量的含有双抗的生理盐水后，整体移入超净工作台。用剪刀和镊子将心脏移除后，沿着肺动脉走向将肺内动脉的左右分支从肺中分离出来。用显微镊仔细剥除动脉外膜的结缔组织，再用加有双抗的生理盐水冲洗2遍；用眼科剪沿肺动脉干纵向剪开肺动脉，暴露出管腔，使内膜面朝上，用弯镊沿着内膜来回轻刮数次，去除内皮细胞；将肺动脉移入新的培养皿中，用加有双抗的生理盐水冲洗3遍。

1.3 组织块贴壁法将肺动脉中膜剪成1 mm3的小块，将组织块均匀铺在用血清浸润孔底的6孔板中，再用无菌盖玻片(24 mm×24 mm)盖在组织块上，可防止组织块漂浮脱落，每孔加入2 mL完全培养液(含20% FBS的DMEM/F12培养液)，使组织块刚好浸没在完全培养液中，将此6孔板放入37℃、5% CO2培养箱中静置培养。在原代培养5 d 进行半换液(弃掉培养瓶中原培养液2.5 mL，再加入新鲜培养液2.5 mL)，此后每2 d换液1次。当原代细胞融合成片后去除组织块，进行传代培养，传代后的细胞用含15% FBS的DMEM/F12培养液培养。

1.4 酶消化法将部分动脉碎块放入含0.2% Ⅰ 型胶原酶(Ⅰ 型胶原酶溶于DMEM/F12培养基后经0.22 μm滤器过滤，胶原酶的体积为组织块体积的5倍)的离心管中，于37℃水浴中振摆消化。待组织块消化呈透明絮状物时(消化时间约6～8 h)，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，用无血清的DMEM/F12培养液漂洗1次，离心弃上清液，用完全培养液(含20% FBS的DMEM/F12培养基)重悬细胞，接种于T25细胞培养瓶中，37℃、5% CO2培养箱中静置培养。在原代培养5 d进行半换液，此后每2 d天换液1次。当原代细胞融合成片时进行传代培养，传代后的细胞用含15% FBS的DMEM/F12培养液培养。

1.5 传代培养及纯化当细胞生长至培养瓶80%～90%融合时，弃培养液，PBS清洗培养瓶1～2次，加入0.25%胰蛋白酶(含EDTA) 1 mL，37℃、5% CO2培养箱中消化2 min；显微镜下观察细胞，待细胞发生皱缩变圆，细胞间隙增大后，加入2 mL完全培养基终止消化；反复轻柔吹打培养瓶壁，使其脱落瓶壁形成细胞悬液，离心弃上清，加完全培养液重悬；以1∶2或1∶3传代接种于新培养瓶，于37℃、5% CO2培养箱中继续培养，每2 d换液1次，3～5 d即可传代，3～10代可用于细胞试验。

在分离血管中膜的过程中，虽然已经去除了大部分血管外膜且肺动脉中内皮细胞含量较少，但仍会有少量成纤维细胞和内皮细胞混杂生长，因此可利用成纤维细胞比平滑肌细胞贴壁快的特点，采用差异贴壁法纯化平滑肌细胞，即在传代时将细胞悬液接种于培养瓶内，放入培养箱内静置15～25 min，使成纤维细胞贴壁，将未贴壁细胞转移至另一培养瓶中，再次静置贴壁，重复上述步骤2～3次即可获得纯化的平滑肌细胞。

1.6 台盼蓝检测细胞活力收集消化后的细胞悬液，血细胞计数板计算细胞数。细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1吹打混匀，3 min内吸取1滴用血细胞计数板计数活细胞及死细胞数目。评价标准：显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，活细胞呈无色透明状，统计存活率[活细胞率(%)=活细胞总数/( 活细胞总数 + 死细胞总数) × 100%]，每管细胞悬液重复3次，取平均数。

1.7 细胞鉴定α-SMA和calponin免疫荧光染色鉴定：将第3代细胞接种于24孔板，培养1～2 d后，待细胞达到70%融合时，PBS洗涤5 min×3次，用4%多聚甲醛固定细胞30 min；PBS洗涤5 min×3 次，再用0.5%TritonX-100透化处理20 min；PBS洗涤5 min×3次，用1% BSA进行封闭1 h；滴加一抗(α-SMA和calponin抗体，1∶100稀释)4℃过夜；PBS洗涤5 min×3次，滴加二抗(山羊抗兔FITC-IgG抗体，1∶400稀释)37℃避光孵育1 h；PBS洗涤5 min×3次，DAPI孵育3 min；PBS洗涤5 min×3次，并于荧光显微镜下进行观察，同时计算阳性细胞百分率。

1.8 计数分析PASMCs生长曲线选用第5代细胞，按1×104个/孔密度接种于24孔板中，每天随机选取3个孔对细胞进行计数，分别用0.25%胰酶将孔内细胞消化成细胞悬液，吸一定量的细胞悬液至细胞计数板，置于显微镜下计数四角大方格内的细胞总数，并按细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×104个/mL计算单位细胞数，计算平均值，根据细胞计数结果绘制生长曲线。

1.9 冻存与复苏细胞冻存：选择对数生长期的细胞进行冻存，在冻存前24 h更换完全培养液，用常规传代方法将细胞消化下来制成细胞悬液，调整细胞密度为(5～10)×106个/mL，转移入冻存管中，4℃放置30 min，-20℃放置20 min，转移至-80℃过夜，置于液氮罐中保存。

细胞复苏：将冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中快速摇晃使细胞解冻，然后转移至无菌离心管中，加入适量完全培养液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜完全培养液制成细胞悬液，于CO2培养箱中培养24 h后更换培养液。

1.10 统计学处理用SPSS 17.0统计分析软件进行数据处理，数据以x±sx表示，差异显著性用独立样本t检验和单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 PASMCs的形态学观察2种方法均能顺利分离出纯的PASMCs。在倒置相差显微镜下观察，组织块贴壁法在原代培养6～8 d可见细胞从组织块边缘迁移萌出，呈游离状向外生长，细胞体积小，形态不一，大部分呈长梭型，少量呈三角形或不规则形(图1A)；10～11 d可见组织块周围细胞爬出较多，致密排列成束(图1B)；13～14 d细胞进入对数生长期，部分区域细胞平行排列成单层或重叠生长为多层，高低起伏，细胞呈典型的“峰-谷”状结构(图1C)。酶消化法消化下来的原代PASMCs悬浮在完全培养液中，3 d可见细胞贴壁呈圆形，5 d可见圆形细胞开始伸展，形态多样呈长梭形、三角形或不规则形(图1D)，7～8 d观察到细胞交织成网状(图1E)，9～10 d细胞呈团簇生长，表现出典型血管平滑肌细胞“峰-谷”状生长的特点(图1F)。传代后PASMCs的细胞形态多呈梭形条状，生长较快，3～5 d即可汇合，并出现典型的“峰-谷”现象。

图1 倒置显微镜观察PASMCs形态(100×) A～C.组织块贴壁法7，11，14 d；D～F.酶消化法5，7，9 d

2.2 台盼蓝染色结果组织块贴壁法共计数1 061个细胞，其中10个为阳性结果，99%为阴性结果；酶消化法共计数1 029个细胞，其中15个为阳性结果，98.5%为阴性结果；说明2种方法分离的细胞传代存活率均较高。

2.3 PASMCs的鉴定结果细胞免疫荧光检测结果显示，2种方法所培养的细胞98%以上的细胞均能表达α-SMA和calponin，荧光显微镜下可见细胞核呈蓝色，呈卵圆形居中，胞质呈橙红色，并且含有大量与细胞长轴平行的纤维细丝，符合PASMCs的特征(图2)。

图2 α-SMA和calponin细胞鉴定(320×) A.α-SMA鉴定组织块贴壁法获得的细胞；B.α-SMA鉴定酶消化法获得的细胞；C.calponin鉴定组织块贴壁法获得的细胞；D.calponin鉴定酶消化法获得的细胞

2.4 PASMCs的生长状态酶消化法培养的PASMCs生长速度略快于组织块贴壁法，但差异不显著(P>0.05)，两者均于6 d达高峰，而后由于接触抑制而下降(图3)。

图3 PASMCs生长曲线图

2.5 细胞冻存与复苏为便于后续的相关研究，细胞需要进行冻存处理。经检测，复苏后的细胞生长状态良好，形态结构稳定，复苏后24 h内能大部分贴壁且生长旺盛。

3 讨论

牦牛作为生活在青藏高原特有的土著物种，其对高海拔低氧环境的良好适应性早已引起国内外学者的关注。牦牛肺动脉中膜平滑肌的增生是对低氧环境的一种适应性结构[7]。本课题组已对牦牛肺脏进行了大量研究，但这些研究主要集中于对牦牛肺脏结构和相关蛋白的分布[3,7-9]。随着研究深入，有必要对PASMCs的适应机理、信号通路等进行详细研究，这就需要大量的体外培养PASMCs。国内外多个报道对鼠、兔、牛、羊及人PASMCs的原代培养进行过研究，有采用组织块贴壁法[10-13]，也有采用酶消化法，其中包括单纯酶消化法[14-16]与复合酶消化法[17-19]。考虑到复合酶消化法采用的酶种类较多，较难控制消化时间，因此本试验采用组织块贴壁法和Ⅰ型胶原酶消化2种不同方法来进行牦牛PASMCs的原代培养。2种方法获得的PASMCs呈长梭形，当细胞融合后呈“峰谷”状生长，表现出典型的血管平滑肌细胞形态学特征，与报道的结果一致[20-21]，2种方法的第5代PASMCs的生长曲线存在一定差异，但差异并不显著。

常见的平滑肌细胞分子标记包括α-SMA、calponin、SMMHC、SM22α、desmin、h-caldesmon和smoothlin等，鉴定SMC一般多采用α-SMA抗体[15,17-19]。然而有研究表明，在特定培养条件下，成纤维细胞向肌成纤维细胞转化也可表达α-SMA[22-23]。因此，要鉴定体外培养的细胞为血管平滑肌细胞，除α-SMA阳性表达外，至少还需要1个其他的平滑肌细胞标记物。故本试验选用了α-SMA和calponin 2种抗体进行免疫荧光染色，结果发现所培养的细胞超过98%呈阳性，说明培养的细胞为平滑肌细胞，为后续的相关研究奠定了基础。

本试验结果表明，2种方法均能成功分离培养出较纯的牦牛PASMCs，但各有优缺点，组织块贴壁法虽操作简单且比较经济，但分离培养周期较长；而酶消化法分离培养周期较短且获取细胞较多，但操作复杂易污染，因此可根据具体情况选用合适的牦牛PASMCs原代分离培养方法。