高浓度HBsAg检测化学发光微粒子免疫分析法的建立及性能评价

刘 杨， 张志平， 彭道荣， 宋浏伟， 葛胜祥， 郝晓柯， 刘家云

（空军军医大学第一附属医院，陕西 西安 710032）

乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的外膜蛋白，主要用于HBV感染的筛查[1]。血清HBsAg定量检测已成为临床抗病毒治疗疗效监测的重要指标。化学发光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）是一种高特异性、高灵敏度、重复性好的检测方法，无放射性污染，可快速检测血清中的小分子物质及肿瘤标志物等[2-3]。目前，我国临床实验室广泛使用的是进口化学发光免疫分析系统。由于绝大部分慢性乙型肝炎患者血清HBsAg水平较高，目前临床常用的检测系统需对样本先进行稀释，然后再检测，不仅降低了工作效率，也加大了检测成本。为此，本研究拟建立定量检测中、高值血清HBsAg的CMIA，并对其进行初步的性能评价。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2014年12月—2015年12月空军军医大学第一附属医院就诊的HBV感染患者268例，其中男135例、女133例，年龄21～67岁，无甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等合并感染。选取同期空军军医大学第一附属医院进行健康体检的表观健康者146名，其中男75名、女71名，年龄23～74岁。本研究所用的血清样本均为常规检测后的剩余血清，-20 ℃保存待检。

1.2 仪器和试剂

重组HBsAg、羊抗HBsAg多克隆抗体Ab1和7株抗-HBsAg小鼠单克隆抗体（Ab2～Ab8）均购自厦门万泰沧海生物技术有限公司，hepatitis E virus（HEV），human immunodeficiency virus（HIV），human T-lymphotropic virus（HTLV），cytomegalovirus（CMV）and Epstein-Barr virus（EBV）positive samples did not cross-react with this assay. The prepared reagent could be stable for 6 d at 37 ℃，it could be stable for 4 weeks after opening lid at 2-8 ℃，and it could be stable for 6 months when stored in a sealed container at 2-8 ℃. The correlation and consistency between self-established CMIA and electrochemiluminescence method were good（r=0.978，P＜0.001）.ConclusionsThe self-established CMIA has a wide linear range for determining HBsAg，high concentration samples can be directly determined without dilution，and the determination performance is good，which has certain clinical application prospects.

Key words：Hepatitis B surface antigen；Hepatitis B virus；Chemiluminescent microparticle immunoassay；Performance evaluation纯度均＞90%。HBsAg突变株WT、G119R、P120T、C124Y、I126S、Q129R、S136P、C139R、T140I、P144A、G145A、G145R、M204U、M204I购自厦门大学国家传染病与疫苗工程技术研究中心。磁微粒（直径约3 μm，微粒表面为羧基修饰）购自上海立驰高化工有限公司。碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC]和N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）购自美国Sigma公司。Caris 200全自动化学发光免疫分析仪（厦门优迈克医学仪器有限公司），cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套HBsAg试剂盒（电化学发光法）。

1.3 自建CMIA试剂的制备

自建CMIA主要有2种试剂，一种是磁微粒与鼠抗-HBsAg单克隆抗体偶联制备的MB试剂，磁微粒与抗体的化学偶联通过EDC和NHS两者联用进行，步骤参照磁微粒使用说明书；另一种是吖啶酯标记抗-HBsAg多克隆抗体，配制成SEA试剂，步骤如下：将50 μg抗体与5 μL吖啶酯溶液（5 mmol/L）在300 μL磷酸盐缓冲液（pH值8.0）中避光反应30 min，加入终止缓冲液（5%甘氨酸）反应30 min，最后避光透析去除游离吖啶酯。

1.3.1 自建CMIA的检测程序 自建CMIA检测原理为双抗体夹心法，检测程序：（1）向反应杯中加入一定量的样本、MB试剂和反应稀释液，混匀后37 ℃孵育15 min；（2）仪器内置磁铁对反应杯中的磁微粒进行集磁，然后对磁微粒洗涤2次；（3）加入SEA试剂混匀重悬磁微粒，37 ℃孵育10 min；（4）仪器内置磁铁对反应杯中的磁微粒进行集磁，然后对磁微粒洗涤4次；（5）反应杯中加入预激发液和激发液，并检测光子信号。

1.3.2 反应的最佳体系 取重组HBsAg抗原用20%婴牛血清（newborn bovine serum，NBS）进行梯度稀释，得到10份阳性系列标准品（依次编号为S1～S10）。5份表面健康者血清样本依次编号为N1～N5。观察S1～S10的相对发光强度（relative light unit，RLU）值与样本浓度的线性关系。将S1～S10的平均RLU值（记为P值）除以N1～N5的平均RLU值（记为N值），得出P/N比值，综合分析上述线性关系及P/N比值，筛选出最佳反应体系。

1.3.3 抗体筛选 将羊抗HBsAg多克隆抗体Ab1标记吖啶酯制备成SEA试剂，7株抗-HBsAg小鼠单克隆抗体（Ab2～Ab8）包被磁微粒制备为MB试剂，将MB试剂与SEA试剂配对检测1例HBsAg阳性血清样本（P）、1例HBsAg阴性样本（N），以及不同HBsAg突变株，评估不同原料对不同样本的检出能力。

1.3.4 抗体最适浓度的筛选 将不同浓度的磁微粒抗体（0.2、0.4、0.8 mg/mL）与不同稀释比例的吖啶酯抗体（1∶100、1∶200和1∶500）进行两两配对筛选，通过P/N比值及标准品的RLU与浓度的线性关系筛选出抗体的最适浓度。

1.3.5 反应稀释液的用量 分别设置0、25、50、100 μL反应稀释液用量，对S1～S10系列标准品进行检测，通过P/N比值及标准品的RLU与浓度的线性关系筛选出反应稀释液的最适用量。

1.3.6 样本加样量的选择 分别设置20、50、80 μL样本加样量，对S1～S10进行检测，通过P/N比值及标准品的RLU与浓度的线性关系筛选出样本最适加样量。

1.3.7 试剂用量的选择 设置25、50、100 μL试剂用量，分别评价MB试剂与SEA试剂的用量对试剂检测范围的影响，通过P/N比值及标准品的RLU值与浓度的线性关系筛选出试剂最适用量。

1.3.8 标准曲线的建立 将HBsAg纯品梯度稀释，制备成6个不同浓度（100 000、20 000、4 000、800、160、32 IU/mL）的标准品（依次编号为S0～S5），测定S0～S5的RLU值，用四参数拟合方式对校准品的检测结果进行拟合，得到标准曲线。

1.4 自建CMIA的性能评价

参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A文件[4]、EP15-A2文件[5]、EP5-A2文件[6]、EP7-A2文件[7]评价自建CMIA的检测性能。

1.4.1 线性范围 将高浓度HBsAg标准品梯度稀释，得到10个浓度（100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、100、20、10、5 IU/mL）的标准品，每个浓度样本平行检测4次，计算。将每个浓度的和RLU值采用Log-Logit数学模型处理后得到剂量-反应曲线及r值。

时间等不起，造价出不起。只有一个办法，自己动手。工程师刘家林、施工队长李德铭和大家一起，研究出一个新的方案：原设计要求在路基2.5米以下用直径1560毫米的钢筋混凝土保护管穿越路基，改用直径377毫米的钢管代替混凝土管，可把管底深度由4.04米减少到2.88米，穿越长度由70米缩短到35米。但是，长距离穿越，稍有疏忽就会造成弯曲，即使缩短为30多米，仍有相当长的距离，如稍有弯曲就会损伤路基。因此，大家仍是提心吊胆，兢兢业业，采取了非常严密的措施，并自己设计制造了一个24米长的顶推滑道，以避免管道穿弯，还选用D80推土机，挑选驾驶技术最熟练的推土机手，把顶推的位置固定死。

1.4.2 检测限 检测HBsAg零浓度值的标准品，重复检测20次，计算RLU的和s，将+2s代入剂量-反应曲线方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限。

1.4.3 精密度 分别重复检测高、低值HBsAg阳性样本10次，连续检测10 d，计算批内和批间精密度[以变异系数（coefficient of variation，CV）表示]。

1.4.4 准确度 检测配制的准确度参考品，测量相对偏差=（实测值-理论值）/理论值×100%。

1.4.5 交叉反应 选择可能与自建CMIA检测HBsAg发生交叉反应的其他病毒阳性样本，如HAV、HCV、HIV、人类嗜T淋巴细胞病毒（human T-lymphotropic virus，HTLV）、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），通过检测特异性观察自建CMIA是否会发生交叉反应。

1.4.6 干扰实验 在HBsAg阳性样本中加入不同浓度的干扰物质（血红蛋白、胆红素、三酰甘油、类风湿因子、抗凝剂）制备成干扰样本，对照样本加入同等体积的0.9%氯化钠溶液，同时检测干扰样本和对照样本，计算相对偏差，相对偏差=（干扰样本-对照样本）/对照样本×100%。如相对偏差≤10%，可认为该浓度的干扰物质对检测无干扰。

1.4.7 稳定性实验 将配制好的试剂在37 ℃条件下放置6 d，评估试剂的热稳定性。将试剂2～8 ℃密封保存6个月，每3个月检测1次，观察试剂的长期保存稳定性。将试剂在仪器上冷藏（2～8 ℃）保存4周，每周检测1次，评价试剂的机上保存稳定性。稳定性评估通过检测系列标准品、阴阳性参考品及高值、低值样本，以线性、准确度、检出限、精密度等指标体现。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件和Graphpad Prism 5软件进行统计分析。采用Pearson相关分析及Bland-Altman一致性检验评价2种方法的相关性和一致性。

2 结果

2.1 抗体筛选

7株抗HBsAg小鼠单克隆抗体中Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6和Ab8对阳性样本和阴性样本的区分度较好。进一步检测不同HBsAg突变株，结果显示Ab3、Ab4、Ab6和Ab8对不同突变株具有互补检出能力，可用于包被磁微粒，制备MB试剂。见图1、图2。

图1 不同抗体反应性评估

图2 不同抗体对不同HBsAg突变株的检测能力

2.2 最适反应条件

2.2.1 抗体最适浓度的筛选 磁微粒抗体最适浓度为0.4 mg/mL，吖啶酯抗体最适稀释比例为1∶200（浓度为250 ng/mL）。

2.2.2 反应稀释液最适用量 当反应稀释液用量为100 μL时，试剂检测范围最优。见图3。

图3 不同反应稀释液用量下RLU与HBsAg浓度的关系

2.2.3 样本加样量 随着样本加样量的增加，试剂检测上限逐渐降低，检测范围逐渐缩小，故样本最适加样量选择20 μL。见图4。

图4 不同样本加样量下RLU和HBsAg浓度的关系

2.2.4 试剂用量 MB试剂用量和SEA试剂用量对检测范围的影响较小，因此2个主要试剂的用量均为50 μL。

2.3 性能评价结果

2.3.1 线性范围 自建CMIA检测HBsAg的线性范围为20～100 000 IU/mL，线性回归方程为Y=0.722X+3.591（r=0.993，P＜0.001）。见图5。

图5 自建CMIA检测HbsAg的剂量-反应曲线

2.3.2 最低检测限 将零浓度标准品的RLU代入剂量-反应方程，得到自建CMIA的最低检测限为9.9 IU/mL。

2.3.3 精密度 自建CMIA检测高、低值HBsAg样本的批内CV分别为8.2%、8.4%，批间CV分别为8.9%、8.7%，均符合要求（CV＜10.0%）。

2.3.4 交叉反应 自建CMIA对其他病毒阳性样本均无明显交叉反应，HBsAg均＜20 IU/mL，特异性为100%。

2.3.5 干扰实验 Hb＜400 mg/L、胆红素＜4 mg/L、类风湿因子＜800 IU/mL、三酰甘油＜2 mg/L、柠檬酸钠＜22 mmol/L、乙二胺四乙酸（ethylenediamineteraacetic acid，EDTA）＜8 mmol/L对自建CMIA检测HBsAg无干扰，相对偏差均＜10%。见表1。

表1 自建CMIA干扰实验结果

2.3.6 稳定性实验 配制好的试剂在37 ℃可稳定6 d，开盖后上机（2～8 ℃）保存可稳定4周，2～8 ℃密封保存可稳定6个月。见表4。

表4 自建CMIA试剂的稳定性实验结果

2.3.7 方法学比较 自建CMIA与电化学发光法检测HBsAg的相关性良好，线性回归方程为Y=1.001X-0.018（r=0.978，P＜0.001），见图6。Bland-Altman散点图显示266份样本中仅有3份（1.13%）样本在95%一致性界限外，低于临床可接受要求（2.5%），2种方法的一致性良好，见图7。

图6 自建CMIA与电化学发光法检测HBsAg的相关性

图7 自建CMIA与电化学发光法检测HBsAg的Bland-Altman散点图

3 讨论

HBV是一种嗜肝性DNA病毒，60%的肝硬化和80%的肝癌是由HBV感染所致[8]。HBsAg是慢性乙型肝炎患者诊断和治疗监测重要的血清学指标，HBsAg由阳性转为阴性是患者免疫清除的最终目标[9]。有研究结果显示，血清HBsAg基线水平和治疗后血清HBsAg水平的下降幅度都可较好地预测患者抗病毒治疗的疗效和预后[10-11]。根据电化学发光法试剂说明书的声明，611例HBV感染者中约有80%的患者血清HBsAg水平分布于100～100 000 IU/mL。ARCHITECT iR2000全自动免疫分析系统（美国雅培公司）的灵敏度较高，但线性范围很窄，仅为0.05～250 IU/mL，高于250 IU/mL的样本需设置500倍稀释重检或手工稀释后重检，这大大降低了检测效率。cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪在首次检测HBsAg时需强制进行400倍稀释，线性范围为20～52 000 IU/mL，低于20 IU/mL的样本需原倍重检，高于52 000 IU/mL的样本需手工稀释后重检。有研究结果显示，与ARCHITECT i2000全自动免疫分析系统相比，cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪对HBsAg突变株的检测能力具有明显优势[12-13]。

综上所述，本研究建立的检测血清HBsAg的CMIA在精密度、特异性、稳定性等方面均符合临床检测要求，与电化学发光法有较好的相关性和一致性。自建CMIA的优势是具有更宽的线性范围（20～100 000IU/mL），可覆盖临床上绝大部分乙型肝炎患者血清HBsAg水平的范围，既降低了因稀释样本造成的实验误差，又降低了检测成本，提高了检测效率。该法的不足之处在于检测＜20 IU/mL的低值样本时有一定的局限性，但这是在提高检测上限时无法避免的问题。临床上血清HBsAg＜20 IU/mL的HBV感染患者很少，针对这部分样本本研究建立了针对低值样本的检测方法。在指导慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的用药选择上，临床对高值样本的检测需求远高于低值样本，因此该局限性并不影响自建CMIA的临床应用价值。另外，自建CMIA的试剂原料大部分为国产，成本较低，获取方便。因此，自建CMIA具有较好的临床应用前景。