RT-PCR快速检测产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌临床应用评价

何丽华， 倪丽君， 杨思敏， 羽晓瑜， 周爱萍， 胡 靓， 郭 建， 吴文娟

（同济大学附属东方医院南院检验科，上海 200123）

近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的广泛应用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）引起的感染不断增多，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率也在全球迅速升高[1-2]。CRKP在医院的暴发流行是引起医院感染患者高死亡率的重要因素[3]。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物最主要的耐药机制[4]，KPC型碳青霉烯酶是我国肺炎克雷伯菌临床分离株中最常见的碳青霉烯酶[5]。快速检测肺炎克雷伯菌和产碳青霉烯酶基因blaKPC，可以及时指导临床抗感染治疗，控制耐药菌在医院内的传播和暴发流行。美国临床实验室标准化委员会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐使用改良Hodge试验（modified Hodge test，MHT） 、Carba NP 试验（Carba NP test，CNP）和改良碳青霉烯酶灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）对产碳青霉烯酶菌株进行表型确证[6]，但这些方法操作繁琐，且进口快速分子检测试剂非常昂贵，不利于常规开展，无法快速、准确地为临床危重患者抗感染治疗提供实验室依据。本研究对某国产荧光定量聚合酶链反应（fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测试剂盒直接检测临床样本中肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白基因blaphoE和blaKPC，快速检测产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的性能进行评估，以期为降低检测成本提供实验室数据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2014—2016年同济大学附属东方医院南院菌毒种库-70 ℃保存的临床分离CRKP菌株89株；另收集2017年8月—2018年11月临床送检痰液样本（剔除同一患者重复送检的样本）226份，直接提取核酸，进行荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测。同时收集痰液样本中分离的肺炎克雷伯菌（剔除分离自同一患者的重复菌株）。

1.2 仪器与试剂

Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪（法国生物梅里埃公司），Autof ms 1000全自动微生物质谱检测系统（郑州安图生物公司），Cobas Z-480型荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司），Natch CS s12a型全自动核酸提取仪（湖南圣湘生物科技有限公司），T1000 Thermal Cycler型PCR扩增仪、Gel Doc EZ型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素KPC基因检测试剂盒（荧光PCR法，宁波基内生物技术有限公司），细菌DNA提取试剂盒[凯杰（北京）有限公司]，核酸提取或纯化试剂（湖南圣湘生物科技有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；革兰阴性菌药物敏感性试验卡（法国生物梅里埃公司）、培养基和药物敏感性试验纸片、培养基和抗菌药物纸片（英国OXOID公司），4% NaOH为本实验室自配。

1.3 方法

1.3.1 样本处理 在痰液样本中加入2倍体积的4% NaOH，摇匀，室温下放置30 min液化，1 256×g离心 5 min。沉淀加1 mL无菌0.9%氯化钠溶液，混匀，1 256×g离心5 min；去尽上清后沉淀用于核酸抽提。用新鲜菌落配置0.5麦氏单位菌悬液50 L，置于1.5 mL Eppendorf离心管中，用于核酸抽提。

1.3.2 培养及鉴定 按常规方法分离培养临床送检的痰液样本，所有分离菌采用全自动细菌鉴定仪和质谱检测系统进行菌种鉴定后，参照2018年CLSI推荐的仪器法和纸片扩散法进行体外药物敏感性试验[5]。收集培养结果为肺炎克雷伯菌的样本和菌株，以及正常菌群生长的痰液样本。

1.3.3 RT-PCR扩增 采用肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素KPC基因检测试剂盒提取临床样本和细菌的DNA模板，按照说明书配制试剂和加样，荧光PCR扩增反应体系为20 μL，反应条件为：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，循环1次；93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次；单点荧光检测温度为60 ℃。选用FAM通道作为blaphoE、blaKPC基因检测的荧光通道，选用JDE通道作为内标基因的检测通道。

1.3.4 PCR扩增 采用PCR扩增blaKPC基因，扩增产物使用一代测序方法进行分析。用新鲜菌落配置0.5麦氏单位菌悬液300 μL，置于1.5 mL Eppendorf离心管中，采用全自动核酸提取仪提取DNA模板。引物序列：F-CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG，R-CTTGTCATCCTTGTTAGGCG；大小为798 bp。反应条件为：94 ℃变性10 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，36个循环；72 ℃延伸5 min。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，采用χ2检验或Fisher精准概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用四格表进行分析，评价检测敏感性、特异性和总符合率。

2 结果

2.1 临床样本和菌株信息

226份痰液样本中有45份分离出CRKP，20份分离出碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitiveKlebsiellapneumoniae，CSKP）。以161份正常菌群生长的痰液样本作为阴性对照，共收集到肺炎克雷伯菌65株。

2.2 RT-PCR和PCR扩增检测CRKP结果

89株CRKP经RT-PCR检测和常规PCR扩增，其中87株检测出blaKPC基因，2株未检出blaKPC基因，blaKPC基因检出率为97.8%，2种分子检测方法符合率为100%，见图1、图2。89株CRKP采用RT-PCR均检测出肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白blaphoE基因，见图3、表1。

图1 RT-PCR blaKPC基因检测结果

图2 PCR扩增blaKPC基因产物电泳图

2.3 临床样本和菌株荧光PCR检测结果

45份检出CRKP的痰液样本中均检出肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白blaphoE基因，其中43份检出blaKPC基因，2份未检出blaKPC基因；同时收集的45株CRKP均检测出blaphoE基因和blaKPC基因。临床样本与菌株检测结果无统计学差异（P＞0.05）。20份检出CSKP的痰液样本和同步收集的20株CSKP中均检出blaphoE基因，但菌株中均未检出blaKPC基因，有1份痰液样本检出blaKPC基因，与菌株检测结果无统计学差异（P＞0.05）。161份阴性对照样本均未检出blaKPC基因，但有1份检出blaphoE基因，与传统培养方法结果比较无统计学差异（P＞0.05），见图4。

图3 RT-PCR blaphoE基因检测结果

表1 89株CRKP RT-PCR和PCR扩增结果 株

2.4 性能评价

2.4.1 荧光PCR检测肺炎克雷伯菌blaphoE与传统培养法比较，荧光PCR检测肺炎克雷伯菌blaphoE的敏感性为100%，特异性为99.38%，2种方法符合率为99.56%。见表2。

图4 226份痰液样本与其对应菌株RT-PCR检测结果

表2 2种方法肺炎克雷伯菌检测结果 株

2.4.2 RT-PCR直接检测痰样本blaKPC基因 与菌株体外药物敏感性试验结果进行比较，2种方法符合率为98.67%，RT-PCR的检测敏感性为95.56%，特异性为99.48%。见表3。

表3 痰液样本和菌株blaKPC基因检测结果 份

3 讨论

碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药菌引起的感染的最有效药物，但近年来碳青霉烯类耐药革兰阴性菌，特别是肺炎克雷伯菌的检出率呈上升趋势[7-9]，使临床抗感染治疗面临巨大挑战。碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制主要包括产碳青霉烯酶、外膜蛋白联合产头孢菌素酶β-内酰胺酶或产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）、药物外排机制或作用靶位的改变[10]。我国碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制主要为产blaKPC型碳青霉烯酶，主要流行传播的克隆株为ST11型[11]。由于目前临床上尚无特效药物，因而通过对此类细菌进行快速检测来及时指导临床合理用药极为重要[12]。

本研究先采用常规PCR方法验证肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素KPC基因检测试剂盒检测89株CRKP菌株blaKPC基因的准确性，再验证采用RT-PCR检测痰液样本中blaphoE基因和blaKPC基因的准确性。结果显示，采用RT-PCR检测89株CRKPblaKPC基因，检测结果与常规PCR扩增结果基本一致，能够特异性地扩增出87株blaKPC基因，2株未扩增出blaKPC基因，可能是由于存在其他碳青霉烯类耐药基因所致。肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素基因KPC检测试剂盒还可以特异地扩增blaphoE基因，结果和临床鉴定结果完全一致，而常规PCR则无此功能。采用RT-PCR对临床痰液样本和菌株分别进行检测，结果显示，直接扩增痰液样本blaKPC基因和检测样本中分离出CRKP，差异无统计学差异（P＞0.05）；有2株blaKPC基因检测结果为假阴性，可能是抽提过程中出现了操作失误，或因样本浓度过低所致，检出CSKP的痰液样本中检出1株blaKPC基因假阳性，阴性对照样本中检出1株blaphoE假阳性，可能是由于操作人员操作不当，或反应液分装冷冻、加样后未及时盖紧瓶盖导致污染所致。

总体而言，本研究226份痰液样本中，与传统培养法比较，RT-PCR检测肺炎克雷伯菌blaphoE的敏感性为100%，特异性为99.38%，2种方法的符合率为99.56%；与体外药物敏感性试验结果比较，RT-PCR直接检测痰液样本blaKPC基因的敏感性为95.56%、特异性为99.48%，2种方法的符合率为98.67%。提示RT-PCR具有较好的检测性能，与常规PCR测序方法比较，仅需2～3 h即可出结果，具有高效、便捷的优点，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素KPC基因检测试剂盒（荧光PCR法）可快速筛查产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，可快速为重症感染患者提供感染治疗依据，有较高的临床应用价值。