头孢他啶/阿维巴坦单独和联合磷霉素碳青霉烯类耐药革兰阴性菌体外抗菌活性研究

陈 涛， 徐 晔， 董郭枫， 周 翠， 徐雯雅， 周铁丽

（1.温州医科大学附属第一医院医学检验中心，浙江 温州 325000；2.襄阳市第一人民医院，湖北 襄阳 441000）

革兰阴性菌作为临床最常见的机会致病菌，广泛存在于医院和自然环境中。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，以及革兰阴性菌易获得耐药基因的特性，导致其耐药性不断增强，逐渐成为一种严重的全球公共卫生威胁[1]。碳青霉烯类抗菌药物是治疗革兰阴性菌感染的首选，近年来也出现越来越多的耐药菌株，使抗感染形势愈加严峻。产生各类β-内酰胺酶是革兰阴性菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因[2]。阿维巴坦（avibactam，AVI）是一种新的非β-内酰胺类β-内酰胺酶抑制剂，属于二氮杂二环辛烷（diazabicyclooctane，DBO）类化合物，与临床使用的抑制剂比较，AVI具有抑酶效果更好、抑菌谱广的优点。2015年2月，AVI与三代头孢菌素——头孢他啶（ceftazidime，CAZ）在美国组合上市，主要用于治疗复杂的泌尿道感染，以及联合甲硝唑治疗复杂的腹腔内感染。该复合药物对革兰阴性菌感染有着良好的治疗效果[3-4]，为临床治疗碳青霉烯类耐药革兰阴性菌感染提供了良好的治疗选择。磷霉素是一种可阻碍细菌细胞壁合成的低分子化合物，在美国被批准用于治疗由革兰阳性和革兰阴性菌引起的尿路感染。磷霉素与β-内酰胺类联合治疗多重耐药（multi-drug resistance，MDR）革兰阴性菌感染正引起研究者们的广泛关注，有研究结果表明，磷霉素和β-内酰胺类（碳青霉烯类和头孢洛扎-他唑巴坦）之间具有协同作用[5-6]。

目前，我国CAZ/AVI对碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的抗菌作用鲜有报道，故本研究收集临床感染最常见的3种革兰阴性菌——大肠埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），评价CAZ/AVI单独和联合磷霉素对这3种碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的体外抗菌活性，为临床合理使用抗菌药物提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2014—2017年温州医科大学附属第一医院碳青霉烯类耐药大肠埃希菌（carbapenemresistantEscherichia coli，CREC）56株、碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）43株和碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）53株，以碳青霉烯敏感大肠埃希菌（carbapenem-susceptibleEscherichia coli，CSEC）51株、碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-susceptibleKlebsiella pneumoniae，CSKP）43株和碳青霉烯敏感铜绿假单胞菌（carbapenem-susceptiblePseudomonas aeruginosa，CSPA）51株作为对照，合计297株。56株CREC中，31株产NDM金属酶，14株产KPC-2酶，11株不产碳青霉烯酶；43株CRKP中，40株产KPC-2酶，1株产IMP酶，2株同时产KPC-2和IMP酶；53株CRPA均不产碳青霉烯酶。所有菌株经VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定，根据VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪的药物敏感性试验结果，按照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）最新标准进行判读，细菌对碳青霉烯类药物中的任意一种耐药即纳入本研究。所有碳青霉烯类耐药革兰阴性菌都经过CLSI推荐的改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）确认碳青霉烯酶表型和基因型[7]。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）和铜绿假单胞菌（ATCC 27853）购自我国国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 抗菌药物

CAZ、阿维巴坦钠（上海源叶生物科技有限公司），磷霉素、葡萄糖-6-磷酸二钠（温州康泰生物技术公司）。

1.3 仪器与试剂

VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪及配套细菌鉴定GNS卡和GN卡、比浊仪（法国生物梅里埃公司），10 μg美罗培南纸片、哥伦比亚血琼脂、M-H琼脂培养基和M-H肉汤培养基（英国OXOID公司）、PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）、PCR反应仪和脉冲场凝胶电泳仪（美国BIO-RAD公司）、电热恒温培养箱（上海森信实验医疗器械厂）、90 mm 塑料平皿（温州倍可特公司）、96孔板（美国康宁公司）、超净工作台（北京东联哈尔仪器公司）。

1.4 方法

1.4.1 琼脂稀释法检测菌株对CAZ/AVI的敏感性 采用CLSI 2018年推荐琼脂二倍稀释法[7]测定待检菌株对CAZ/AVI的敏感性。CAZ/AVI的浓度测定范围为0.12/4 μg/mL～128/4 μg/mL。将分离纯化后的临床分离株及质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）接种于血平板，置于37 ℃培养箱孵育16～18 h后，从新鲜过夜的培养板上挑取单个菌落于2 mL M-H肉汤中，置于37 ℃恒温震荡培养箱200 r/min培养6～8 h，用无菌M-H肉汤将菌液调至0.5麦氏浊度后将其10倍稀释，接种到M-H琼脂平板上，每点接种量为1×104CFU，分别测定CAZ/AVI对各菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。结果依据2018版CLSI药物折点判读标准进行判断[7]，肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌对CAZ/AVI的MIC≥16/4 μg/mL判断为耐药，≤8/4 μg/mL则判断为敏感。

1.4.2 微量棋盘稀释法检测CAZ/AVI和磷霉素的联合抗菌作用 采用微量棋盘稀释法测定CAZ/AVI联合磷霉素后的联合抗菌作用[8]。将CAZ/阿维巴坦钠按临床使用的比例（4∶1）配成复合药物，根据菌株的MIC值将CAZ/AVI和磷霉素分别配置成一定浓度的原液，使最终组合的药物浓度分别为2/0.5 μg/mL～256/64 μg/mL和1 μg/mL～2 048 μg/mL，并保证每个孔里包含有25 μg/mL的葡萄糖-6-磷酸二钠。按照棋盘法设计，每孔分别加入50 μL CAZ、AVI和磷霉素，同时加入100 μL稀释后的菌液，37℃培养16～18 h后，记录各组合和最佳组合时各种药物的MIC（甲药联用的MIC和乙药联用的MIC）值，并计算部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）值。联合用药的两药相互作用效果主要采用FICI进行评价，FICI=FIC甲药+FIC乙药=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用[FIC为部分抑菌浓度（fractional ihibitory concentration）]。FICI判断标准为：FICI≤0.5为协同作用，0.5＜FICI≤1.0为相加作用，1.0＜FICI≤2.0为无关作用，FICI＞2.0为拮抗作用。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAZ/AVI对碳青霉烯类耐药和敏感革兰阴性菌的体外抗菌活性

297株革兰阴性菌对CAZ/AVI的总耐药率为18.18%，其中152株碳青霉烯类耐药革兰阴性菌对CAZ/AVI的耐药率为30.26%，显著高于碳青霉烯敏感菌株的5.52%（P＜0.05）。在大肠埃希菌和铜绿假单胞菌中，碳青霉烯类耐药菌株对CAZ/AVI的耐药率（39.29%和37.74%）显著高于碳青霉烯敏感菌株（1.96%和7.84%）（P＜0.05）；然而在肺炎克雷伯菌中，CRKP对CAZ/AVI的耐药率为9.30%，与CSKP（6.98%）比较差异无统计学意义（P＞0.05）；CRKP对CAZ/AVI的耐药率（9.30%）显著低于CREC和CRPA（39.29%和37.74%）（P＜0.05）。见表1。对CAZ/AVI敏感的CRKP的总体MIC分布要较CREC更接近于耐药折点（P＜0.05），见表2。产NDM金属酶的碳青霉烯类耐药革兰阴性菌对CAZ/AVI的耐药率为67.74%，显著高于产KPC-2酶（7.41%）和不产酶（32.81%）的碳青霉烯类耐药菌株（P＜0.05），见表3。

2.2 CAZ/AVI联合磷霉素对碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的体外抗菌活性

从耐CAZ/AVI的3种碳青霉烯类耐药革兰阴性菌中各随机挑选3株菌株（CREC：DC2003、DC7969、DC8085；CRKP：FK2784、FK2938、FK2993；CRPA：TL2855、TL2864、TL2867）进行微量棋盘稀释法药物敏感性试验。结果显示，9株碳青霉烯类耐药革兰阴性菌中，CAZ/AVI和磷霉素联用后，2种药物的MIC值较单用时均有所降低。在CREC中，CAZ/AVI与磷霉素联用后的FICI均分布在0.5～1.0的范围内，均表现为相加作用。在CRKP与CRPA中，CAZ/AVI与磷霉素联用后的FICI均≤0.5，均表现为协同作用。见表4。

表1 革兰阴性菌对CAZ/AVI的耐药情况

表2 CAZ/AVI敏感不同碳青霉烯类耐药革兰阴性菌MIC分布情况比较 株

表3 CAZ/AVI对不同表型/基因型革兰阴性菌的耐药情况

表4 CAZ/AVI联合磷霉素的MIC值及其FICI

3 讨论

细菌耐药性的增强是一个严重的全球公共卫生问题，由耐药细菌引起的感染有着较高的发病率和病死率。目前，MDR革兰阴性菌，尤其是碳青霉烯类耐药的革兰阴性菌，是医院和社区感染的一大威胁[9]。由于细菌对经典抗菌药物的耐药率不断增高，学者们开始关注临床上新的抗菌药物以对抗这些棘手的耐药菌株。β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合因对产β-内酰胺酶的菌株具有良好的抑菌作用而得到研究者们的关注。早前使用的经典酶抑制剂通过与β-内酰胺酶结合，形成稳定的非共价化合物达到抑酶作用，但同时自身结构也遭到破坏。而新的酶抑制剂AVI却具备独特的抑酶机制，其与β-内酰胺酶共价结合后，可再经环合使自身结构不发生改变，因此具有更长效的抑酶作用[10]。同时，AVI的抑酶谱更广，可有效抑制Ambler A类、C类和部分D类β-内酰胺酶[11]。CAZ/AVI作为新的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合，对MDR革兰阴性菌有着良好的抗菌作用[12]。因此，本研究对该复合药物进行研究，以期能应对临床棘手的碳青霉烯类耐药革兰阴性菌。

本研究结果显示，3种革兰阴性菌对CAZ/AVI的总耐药率为18.18%，较国外报道的耐药率更高[13]。此外，碳青霉烯类耐药革兰阴性菌对CAZ/AVI的总耐药率高达30.26%，显著高于碳青霉烯敏感菌株的5.52%（P＜0.05）。CAZ/AVI作为除多黏菌素以外最有前景的复合药物，目前已存在这么高比例的耐药菌株，提示临床上革兰阴性菌的耐药形势已经非常严峻。CREC对CAZ/AVI的耐药率高达39.29%，与大肠埃希菌主要产AVI无法抑制的NDM金属酶有关，本研究中，产NDM金属酶的碳青霉烯类耐药革兰阴性菌对CAZ/AVI的耐药率为67.74%，与国外的研究结果相似[14]；CRPA的耐药率达37.74%也与铜绿假单胞菌几乎不产β-内酰胺酶有关；而CRKP对CAZ/AVI展现出了良好的敏感率，这与AVI可以显著抑制KPC-2酶有着密切的关系，与国内外文献报道相符[15-16]。本研究结果还显示，在肠杆菌科细菌中，虽然CRKP对CAZ/AVI的耐药率明显低于CREC，但对CAZ/AVI敏感的CRKP的总体MIC分布却较CREC更接近于CLSI规定的耐药折点。这可能意味着未来几年，同时耐碳青霉烯和CAZ/AVI的肺炎克雷伯菌将会不断出现，造成可供使用的抗菌药物进一步减少。

磷霉素对革兰阴性菌具有良好的杀菌作用。在一些国家，静脉注射磷霉素已被用于治疗包括肺炎在内的各种类型的感染[17-18]。同时，磷霉素因其单独使用时耐药性突变产生的频率较高，因此经常被选作联合用药的对象之一。有研究结果表明，合理的联合用药比单药治疗更灵活，并且可降低单药治疗时发生的单药耐药性的风险，缓解临床治疗压力[19]。因此，为了解决单独使用CAZ/AVI时耐药率较高的问题，以及避免新的CAZ/AVI耐药菌株的出现，本研究考虑了一种联合用药方案——CAZ/AVI联合磷霉素，并进行了棋盘实验以验证该方案的可行性，结果表明CAZ/AVI联合磷霉素在体外对CRKP和CRPA表现为协同作用，不存在无关和拮抗作用，与文献报道结果[8，20]相符，证实了本研究对CAZ/AVI联合磷霉素抗菌效果的猜想，通过AVI靶向抑制β-内酰胺酶，CAZ和磷霉素可以无阻碍地破坏细菌细胞壁，从而使用2种不同的策略杀死细菌。但本研究中CAZ/AVI联合磷霉素对2株产NDM金属酶的CREC只显示出相加作用，也从侧面反映了该联合方案的局限性是缺乏对产金属β-内酰胺酶细菌的有效作用。为了克服这一困境，有研究人员提出了CAZ/AVI联合氨曲南的策略。氨曲南是一种单环β-内酰胺类抗菌药物，由于其对青霉素结合蛋白的强效和特异性亲和力，因此不会被金属β-内酰胺酶水解，同时保留了对许多革兰阴性菌的抗菌活性，但氨曲南容易被大多数丝氨酸β-内酰胺酶水解，因此AVI的加入正好解决了这一问题。近期也有研究结果表明CAZ/AVI联合氨曲南对包括产NDM酶大肠埃希菌在内的产金属酶肠杆菌科细菌表现出协同作用[21]。但鉴于体外药物敏感性试验与人体内真实情况存在一定差异，以及患者感染程度、药物特性、实验菌株数量及认知水平的局限性，对于这些联合用药方案的临床价值还需进行深入探究，以评估其临床有效性和安全性，为碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的治疗奠定基础。

综上所述，CAZ/AVI对CRKP有着良好的体外抗菌活性，可以作为临床治疗CRKP的首选抗菌药物之一。此外，CAZ/AVI联合磷霉素可能成为一种治疗3种常见碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的新的治疗策略，但效果需要进一步的评估。