1个复合杂合突变导致的凝血因子Ⅺ缺陷症家系表型及基因型分析

毕晓洁， 黄道超， 金先富， 姜俊宇， 苏正仙， 陈超超， 沈 波

（1.温州医科大学附属台州医院检验科，浙江 临海 317000；2.温州医科大学附属台州医院急诊科，浙江 临海 317000）

遗传性凝血因子（coagulation factor，F）Ⅺ缺陷症为罕见的常染色体隐性遗传病，于1953年首次被ROSENTHAL等[1]报道，目前，突变类型已超过200多种（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=F11），国外统计的发生率为1/500 000～1/1 000 000，不同发病率存在种族差异[2]。我国对于遗传性FⅪ缺陷症的报道较少，具体的致病机制也不是很明确。本研究对1例遗传性FⅪ缺陷症进行表型和基因型研究，探究其分子致病机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 家系资料 该家系共8人，包括先证者及父亲、母亲、姐姐、姐夫、外甥女、儿子、妻子。家系谱见图1。先证者，男，36岁，因反复鼻衄入院。实验室常规凝血功能检查示：活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APPT）显著延长，FⅪ活性（FⅪ：C）极低，D-二聚体（D-dimer，DD）轻度升高，其余指标均在参考区间内。先证者肝、肾功能正常，未使用抗凝药物。先证者父母非近亲结婚，其他家系成员均无自发出血或血栓形成病史。

1.1.2 正常对照组 以140名体检健康者作为正常对照组，其中男72名、女68名，年龄40（21～62）岁。无肝、肾疾病，无血栓或出血史。

图1 遗传性FⅪ缺陷症家系图

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 STA-R全自动血凝仪（法国STAGO公司）、AU5830全自动生化分析仪（美国雅培公司）、ABI Thermal cycler 2720 PCR扩增仪（美国ABI公司）、核酸蛋白分析仪（美国Beckman Coulter公司）、电泳仪（美国Bio-Rad公司）、凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.2.2 试剂 凝血项目检测试剂盒购自法国STAGO公司。DNA提取试剂盒、抗原检测试剂盒及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒均购自上海西塘生物科技技术公司。

1.2.3 引物 引物序列参考文献[3]，由华大基因生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本采集和处理 采集所有受试者外周血，用0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝。上层血浆用于凝血项目检测；下层血细胞用于提取DNA，提取完成后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 凝血项目检测 在全自动血凝分析仪上采用一期凝固法检测凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、APTT、纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、FⅡ活性（FⅡ∶C）、FⅤ活性（FⅤ∶C）、FⅦ活性（FⅦ∶C）、FⅧ活性（FⅧ∶C）、FⅨ活性（FⅨ∶C）、FⅩ活性（FⅩ∶C）、FⅪ活性（FⅪ∶C）及FⅫ活性（FⅫ∶C）；免疫比浊法检测纤维蛋白（原）降解产物[fibrin（fibrinogen）degradation product，FDP]、DD；采用酶联免疫吸附试验检测FⅪ抗原（FⅪ∶Ag）水平。

1.3.3 抽提外周血基因组DNA 使用DNA提取试剂盒提取所有成员以及正常对照组外周血基因组DNA。

1.3.4 PCR扩增及电泳 PCR反应总体积为50 μL，其中DNA模板3 μL、PCR MaserMix 25 μL，双蒸水18 μL，上、下游引物各2 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 DNA测序及分析 PCR产物进行直接测序，测序结果采用Chromas软件与GenBank中的基因序列进行比对，发现突变后进行反向测序予以验证。

1.3.6 生物学信息软件分析 采用Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2）和SIFT（http：//sift.jcvi.org）3个在线生物信息软件，通过评分预测突变位点对蛋白质功能的影响。

2 结果

2.1 凝血指标检测结果

先证者以及家系成员凝血功能检测结果见表1。

2.2 基因分析结果

先证者F1 1基因1 1号外显子存在c D N A.1 6 4 0 G＞A，1 4号外显子存在cDNA.2183G＞A，导致Ala430Thr和Val611Met复合杂合突变。见表2、图2和图3。

表1 先证者及家系成员凝血指标检测结果

表2 先证者及家系成员基因突变检测结果

图2 先证者及父亲F11基因11号外显子Ala430Thr突变及野生型

图3 先证者、母亲、儿子、姐姐F11基因14号外显子Val611Met突变及野生型

2.3 生物学信息软件分析结果

PolyPhen-2评分为1.00分，提示此突变为有害突变；Mutation Taster评分结果为disease causing，提示此突变可引起疾病；SIFT评分为0.10分，提示此突变可引起蛋白质功能改变。

3 讨论

FⅪ是一种丝氨酸蛋白酶原，相对分子质量为16 000，在血浆中其主要与高分子量激肽原以非共价形式结合形成复合物[4]。编码FⅪ的基因F11位于4号染色体长臂（4q35），共含有15个外显子和14个内含子，全长23 kb[5]，l号外显子编码的是5'端非转录区，2号外显子编码前导肽链，3-15号外显子共编码607个氨基酸分子，形成的FⅪ包括含有4个Apple结构域的重链以及1个胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化区的轻链。成熟的FⅪ分子含有2个相同单体，由2个残基Cys321形成二硫键组成[6]。

根据经典凝血瀑布学说原理，FⅪ在内源性凝血途径中发挥重要作用。FⅪ在凝血过程中被活化的FⅫ、凝血酶或自身裂解所激活，生成活化的FⅪ[7]，再通过一系列的凝血因子逐级活化过程，最终激活纤维蛋白原，形成纤维蛋白网，使血小板形成的团块更加牢固[8]。FⅪ缺陷临床表现多样，突变基因杂合子的血浆FⅪ水平为正常人的30%～70%，而纯合子的血浆FⅪ水平仅为正常人的0～20%[9]。该病患者无性别差异，与血友病A和B相比，出血症状相对较轻，且一般无自发性出血，出血常与创伤和手术相关[10]，因此疾病的诊断和治疗都存在多变性。原因可能是FⅪ参与凝血过程的放大阶段而不是影响凝血的起始阶段，并且活化的血小板颗粒含有FⅪ，总活性得到一定的补偿，因此FⅪ缺陷症患者多数是在手术、创伤后才会表现出止凝血障碍[11]。而出血的严重程度常与累及的组织部位有关，原因是FⅪ还可引起凝血酶激活纤溶抑制物缺乏，因此在纤溶活性高的组织更容易出血，常见于黏膜[12]。

本研究中的先证者APTT延长至162 s，APTT纠正试验可以纠正，排除因抑制物引起的获得性凝血因子异常；FⅪ∶C为2%，FⅪ∶Ag为3.6%，活性与抗原成等比例下降，呈交叉反应物质阴性特点。先证者父亲、母亲、姐姐及儿子均存在不同程度的FⅪ∶C和FⅪ∶Ag等降低。基因测序结果显示，先证者F11基因的11号外显子存在cDNA.1640G＞A，14号外显子存在cDNA.2183G＞A，导致Ala430Thr和Val611Met复合杂合突变，分别来自于父亲和母亲，可以诊断为遗传性FⅪ缺陷症。

11～15号外显子编码的是多肽链的羧基端[14]，是1个胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域，与FⅪ活化有关，发生在该区域的突变会导致空间构象产生变化，最终使多肽链的折叠发生异常，蛋白质的稳定性变差，极易被降解，FⅪ活化发生障碍。Ala430位于α螺旋结构内部，丙氨酸被苏氨酸替代后，与其周围的Phe433和Tyr436空间位阻发生改变，α螺旋结构稳定性变差[13]。该研究中患者FⅪ∶C为48.6%，FⅪ∶Ag为50%，无任何出血症状，与本研究先证者父亲的表型类似，14号外显子存在cDNA.2183G＞A，该突变是目前国际上发现的新的突变位点。611号缬氨酸突变为甲硫氨酸，分子链变短，与周围氨基酸的作用力发生改变，蛋白质稳定性变差。

综上所述，Ala430Thr和Val611Met复合杂合突变是导致本例患者FⅪ∶C明显下降的主要原因。但具体作用机制尚待进一步研究加以证实。