健康人群血清25-羟基维生素D水平分析

张素洁， 居 漪， 李 卿， 孙贺伟， 冯雪晴， 金中淦， 李水军， 李玉杰， 李金蓉

（1.上海市临床检验中心，上海 200126；2.上海市徐汇区中心医院 复旦大学附属中山医院徐汇医院，上海 200031；3.成都新基因格医学检验所有限公司，四川 成都 611130；4.上海枫林医药医学检验有限公司，上海 200231）

维生素D为脂溶性的固醇类衍生物，与钙和磷的吸收和贮存有关，有预防和治疗佝偻病的作用[1]。维生素D缺乏是一个全球性的公共卫生问题，且维生素D缺乏可能与糖尿病、心血管疾病和肿瘤等均密切相关[2-4]。维生素D在体内主要以维生素D2和维生素D32种形式存在，前者主要来源于植物性食物和补充剂，后者则主要来源于动物性膳食及经紫外线照射后自身合成。维生素D2和维生素D3经血液循环后进入肝脏分别转化为25-羟基维生素D2[25-hydroxyvitamin D2，25（OH）D2]和25-羟基维生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3]，总称为25-羟基维生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]，然后在肾脏转化成1，25-羟基维生素D发挥生理活性[5]。25（OH）D在人体内较稳定，半衰期为3周，且浓度较高，能反映食物摄入和自身合成的维生素D总量以及人体对维生素D的转化能力。因此，25（OH）D被认为是衡量维生素D营养状态的最佳指标[6]。美国医学研究会推荐健康人群血清25（OH）D＞20 ng/mL有利于骨骼健康[7]。然而，维生素D水平与年龄、人种、肤色、生活习惯等息息相关，目前我国还没有统一的25（OH）D参考区间。为此，本研究拟对国内不同地区、不同人群中维生素D的分布进行分析，为今后建立统一的参考区间提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年4—8月上海市徐汇区中心医院中心实验室、上海枫林医药医学检验有限公司和成都新基因格医学检验所检测维生素D的表面健康者974名，其中男454名、女520名，年龄1～100岁。这3家实验室均参加2018年度上海市临床检验中心组织开展的质谱法25（OH）D2和25（OH）D3室间质评和正确度验证计划，且2次评价结果均与靶值较为接近。

1.2 排除标准

所有入选者均为未服用维生素D补充剂，无急性感染、慢性感染、消化系统疾病、肾脏疾病、代谢性疾病、营养性疾病、风湿病、内分泌疾病或循环系统疾病，在过去6个月内未接受手术或接受药物治疗、未献血或输血。

1.3 方法

3家实验室均采用同位素稀释液相色谱串联质谱法（isotope dilute liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID LC-MS/MS）检测25（OH）D2和25（OH）D3。具体步骤：在血清样本中加入一定量的稳定同位素标记的25（OH）D2/25（OH）D3内标，混合均匀后通过一系列预处理方法，将25（OH）D2和25（OH）D3从血清中萃取出来。根据标准曲线，采用ID LC-MS/MS检测血清25（OH）D2、25（OH）D3和内标特异的离子质量。根据25（OH）D2和25（OH）D3及对应内标的峰面积的比值，计算出血清25（OH）D2和25（OH）D3浓度[8]。

1.4 统计学方法

采用MedCalc 15.8软件进行统计分析。采用Dixon法确定离群值[9]。采用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney检验。相关性分析采用Spearman相关分析。采用百分位数法确定第2.5百分位数和第97.5百分位数的分布[10]。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 离群值检验

根据Dixon法检验结果，有23个离群值数据，最终有效统计数据为951个。

2.2 25（OH）D2和25（OH）D3数据分布

正态性检验结果显示，951名表面健康者血清25（OH）D2和25（OH）D3检测结果均呈非正态分布（P＜0.001）。按性别分组，男、女性血清25（OH）D2和25（OH）D3检测结果也均呈非正态分布（P＜0.01）。

女性血清25（OH）D3和25（OH）D水平均高于男性（P＜0.05、P＜0.01），血清25（OH）D2水平男、女性之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同性别表面健康者血清25（OH）D2、25（OH）D3和25（OH）D水平的比较ng/mL，M（P25～P75）

2.3 不同年龄男、女性表面健康者25（OH）D水平的比较

将男、女性表面健康者按年龄分为1～17岁组、18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组、60～69岁组、70～79岁组、80～89岁组、90～100岁组。1～17岁组男、女性25（OH）D水平均高于其他各年龄组（P＜0.01），18～79岁各年龄组间之间25（OH）D水平差异均无统计学意义（P＞0.05），80～89岁组、90～100岁组25（OH）D水平低于其他各年龄组（P＜0.05、P＜0.01）。同年龄组男、女性之间比较，50岁以上各组女性25（OH）D水平高于男性（P＜0.01），其他各年龄组男、女性之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1。

表2 不同年龄男、女性表面健康者25（OH）D水平分布 M（P25～P75）

图1 不同年龄男、女性表面健康者血清25（OH）D水平的变化趋势

2.4 表面健康者血清25（OH）D水平分析

采用百分位数法统计表面健康者血清25（OH）D水平，女性为3.5～31.5 ng/mL，男性为2.7～29.8 ng/mL。见表3。

表3 表面健康者血清25（OH）D水平统计

3 讨论

目前，临床上有多种方法检测人血清25（OH）D水平。根据方法原理不同，分为酶免疫分析法和色谱法。由于所有的维生素D羟化物均可发生抗原抗体反应，故酶免疫分析法只能检测25（OH）D的总量，无法区分25（OH）D2和25（OH）D3。另外，酶免疫分析法对基质效应敏感，容易与其他非目标化合物产生交叉反应，特异性较低。色谱法包括高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）[11]。其中LC-MS/MS是色谱法中最常用的方法，可同时检测25（OH）D2和25（OH）D3，具有特异性高、分析时间短、样本用量少等特点，被认为是“金标准”检测技术。

维生素D有众多的骨骼效应和非骨骼效应。25（OH）D是目前公认衡量维生素D营养状态的最佳指标，因此临床上对25（OH）D的检测需求越来越大。目前，国内的参考标准大部分采用的是酶免疫分析法，这种方法对基质效应敏感，易产生交叉反应，造成检测值偏高[12]。为此，本研究选取了参加上海市临床检验中心开展的质谱法25（OH）D2和25（OH）D3室间质评和正确度验证计划，且结果与靶值较为接近的3家实验室，统一采用ID LC-MS/MS进行检测，保证了检测方法的准确性和一致性。

本研究采用多中心、回顾性分析方法，参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP28-A3c文件和我国卫生行业标准WS/T 402—2012，对不同地区3家实验室的25（OH）D2和25（OH）D3检测数据进行分析。本研究结果显示，951名表面健康者中男女比例为0.9∶1，但60岁及以上的表面健康者偏多，占总人数的69%。因此，本研究对60岁及以上的表面健康者也以10岁为区间进行分组统计。结果显示，1～17岁组男、女性的25（OH）D水平均高于其他年龄组（P＜0.01）；80～89岁组、90～100岁组25（OH）D水平低于其他各年龄组（P＜0.05、P＜0.01），25（OH）D水平整体呈随年龄增长而下降的趋势。本研究中仅有87例（9%）受试者25（OH）D2≥2.5 ng/mL（最大值为27.5 ng/mL），所以无法单独对25（OH）D2进行分析，这是否是由各实验室25（OH）D2检测限不同或其他原因导致的还需要进一步研究。

综上所述，基于ID LC-MS/MS的健康人群血清25（OH）D水平的研究对于维生素D参考区间的建立有重要价值，后续研究将着重对健康人群25（OH）D2水平进行探讨，以便给临床相关疾病的诊治提供更多参考。