基于网络药理学探讨《时病论》春温首方治疗流行性感冒的作用机制

刘 毅,贾跃进

(1.山西中医药大学,山西 太原030024;2.山西中医药大学附属医院,山西 太原030024)

流行性感冒(简称流感)是一种因流感病毒引起并由空气传播的急性呼吸系统疾病,具有高度传染性[1]。在20世纪曾发生3次流感大流行,造成大量人口死亡,目前每年仍呈季节性流行[2],威胁着全球人类健康安全[3]。研究认为,早期的抗病毒治疗是治疗流感的有效方法[4],而现代医学仍缺乏相关的有效抗病毒药物[5],因此挖掘中医药疗法可为流感的治疗提供一定的思路。《时病论》是清·雷丰所著的温病学著作,本文所选用方剂为春温首方,该方由防风、桔梗、陈皮、苦杏仁、淡豆豉、葱白组成,功效为辛温解表,可解寒伤于表,内有伏气。现代药理学研究认为,该方各组分有抗病毒、解热镇痛、抗炎、止咳、抗肺损伤等作用[6-11]。《流行性感冒诊断与治疗指南》中认为轻症中风寒束表为其重要证型[12],故用辛温解表的春温首方对症治疗。中药治疗具有整体性、多靶点、多通路的特点,体现了其复杂的网络特质,因此网络药理学可为研究复杂中药体系提供新思路[13]。本文使用网络药理学的方法分析《时病论》春温首方治疗流感的可行性与作用机制,以期为临床治疗提供参考。

1 方法

1.1 药物活性成分与靶点搜集 利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php),分别以春温首方各药物为关键词检索,并限定OB(oral bioavailability)≥30%,DL(drug-likeness)≥0.18,筛选出活性成分及对应靶点,并在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2 疾病靶点与药物-疾病交集靶点获取 以“influenza”为关键词检索GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/＃)数据库,得到流感疾病靶点。将1.1中药物活性成分靶点与疾病靶点取交集,并绘制Venn图。

1.3 疾病-药物-成分-靶点网络及蛋白相互作用(PPI)网络构建 分别取疾病、方剂、活性成分、靶点作为节点,边为其关联关系,借助CytoscapeV3.6.0构建网络。另外,将1.2中交集靶点导入String数据库(https://string-db.org/),构建PPI网络并利用Cytoscape分析节点度(degree),筛选出核心靶点网络。

1.4 GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 借助Metascape(https://metascape.org/)平台,将1.2中交集靶点分别进行GO生物过程、分子功能、细胞成分和KEGG通路富集分析,并利用在线作图平台ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)绘制富集气泡图。

2 结果

2.1 药物活性成分与靶点搜集结果 通过检索TCMSP数据库并限定药物OB、DL值筛选活性成分,结果见表1。经查重排除后,春温首方全方共搜集到45种活性成分,163个关联靶点。

表1 春温首方中活性成分基本信息

2.2 疾病靶点及药物-疾病交集靶点获取结果 检索共获得流感靶点480个。将2.1中163个药物关联靶点与其取交集,得到46个交集靶点。

2.3 疾病-药物-成分-靶点网络及蛋白质相互作用(PPI)网络构建结果 使用Cytoscape构建疾病-方剂-药物-成分-靶点网络,得到214个节点、637条边。分析可得知节点度较大(Degree＞二倍中位数)的关键活性成分有7种:木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、川陈皮素(nobiletin)、刺槐素(acacetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。利用String获取PPI网络,其中节点表示靶点,边为蛋白互作关系,图中有46个节点、454条连线,平均节点度为19.4。再用Cytoscape分析PPI网络,并选取节点度＞27者为核心靶点,共得出8个核心靶点。

2.4 GO和KEGG通路富集分析结果 利用Metascape将交集靶点进行GO、KEGG通路富集分析。其中GO生物过程、分子功能、细胞成分分别获得1 028、52、31条结果;KEGG通路富集分析得出133条结果。然后设定P值＜0.01,最小计数为3,富集因子＞1.5,分别取其前20、10、7、16的富集项,绘制富集气泡图。结果可见:GO生物过程主要为细胞因子介导的信号通路、对细胞因子产生的积极调节、分化白细胞、活化T细胞等;GO分子功能主要有细胞因子受体结合等;GO细胞成分主要涉及膜筏等;KEGG通路主要包括AGERAGE信号通路、HIF-1信号通路、疟疾、NF-κB信号通路、HTLV-I感染、单纯疱疹感染、JAK-STAT信号通路等。

3 讨论

流感属中医“疫病”范畴,也称“时行感冒”。《黄帝内经》载:“五疫之至,皆相染易,无问大小,病状相似。”[14]描述了疫病的发病特点。张仲景则将疫病统归于伤寒[15]。《温疫论》曰:“温疫之为病,非风,非寒,非湿,乃天地间别有一种异气所感。”[16]阐释了疫病的病因。吴瑭揭诸温之大纲,细致划分疫病,认为三焦各自“有风温、有温热、有温疫、有温毒、有暑温、有湿温、有秋燥、有冬温、有温疟”[17]。因此,中医对该类疾病有较深刻的认识。

本研究所得46个交集靶点与45种活性成分相关,可见各药物成分间有协同作用。分析疾病-药物-成分-靶点网络所得的关键活性成分,其中山柰酚是存在于多种植物中的天然黄酮醇,研究认为其可抑制炎性细胞功能,并抑制促炎细胞因子和趋化因子,从而发挥抗炎作用[18];木犀草素可通过AKT/Nrf2和NF-κB途径对小鼠肺损伤有保护作用[19],研究证实其在体内和体外均有较强的抗炎活性[20],主要通过包括核因子(NF)-κB途径中的Src、激活蛋白(AP)-1途径中的MAPK发挥作用;黄芩素可通过调节AMPK激活表现有效抗流感活性[21],同时其具有防止小鼠急性肺损伤和炎症的效果[22]。根据PPI所得的核心靶点,大致可分为半胱天冬酶(CASP3)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAPK14)、白介素(IL-6、IL-10)和前列腺素G/H合酶(PTGS2)。

通过GO和KEGG通路富集分析,得知春温首方干预流感的主要生物过程及主要通路,其中生物过程多为免疫反应过程;通路中HTLV、单纯疱疹为病毒感染,与流感发病原因相似;而与以上通路关联较多的靶点为IL-6,IL-6是有多种生物学功能的细胞因子,是急性期炎症反应的有效诱导剂,与B细胞、淋巴细胞和单核细胞的分化有关[23]。研究显示,流感的炎症反应产生IL-6,而抑制IL-6在许多炎性疾病包括病毒感染中具有治疗作用[24]。另外,HIF-1信号通路在感染中起到重要作用[25]。NF-κB信号通路是先天性和适应性免疫反应的关键之一[26]。JAK-STAT信号通路则是与涉及自身免疫和炎性疾病发病机制的细胞因子相关的通路[27]。

综上所述,通过中医理论、网络药理学和分子层面的研究,本文初步揭示了《时病论》春温首方通过“多成分、多靶点、多通路”治疗流感的可行性,以及在抗病毒、抗炎、调节免疫等方面发挥作用的相关机制,为临床应用中药治疗流感和进一步研究提供理论参考。