同源盒基因A13降低胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性及其机制研究

陈正谦，周崇治

上海交通大学附属第一人民医院普外科，上海200080

人口老龄化进程加剧是中国恶性肿瘤发病率上升的重要原因之一。胃癌与年龄有密切关系，老年人群发病率较高[1-2]。胃癌早期症状不明显，多数老年患者基础疾病多且确诊时多处于临床中晚期或已发生远处转移[3]。化疗是胃癌的重要治疗手段之一，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）为基础的辅助化疗，能有效改善老年胃癌患者的预后，然而化疗耐药性制约了化疗疗效[4-5]。因此，探讨胃癌化疗耐药的相关机制有助于为老年胃癌患者的化疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI1640 培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（中国江苏新赛美公司）；ECL 化学发光试剂盒（美国Millipore公司）；过表达、敲减慢病毒及阴性对照（中国上海吉满公司）；抗体（英国Abcam 公司）；Tubulin 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；CCK-8 试剂盒（日本Dojindo 公司）；EdU 检测试剂盒（中国广东锐博公司）；Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒（中国浙江联科生物公司）；Trizol（日本Takara 公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix（中国上海翊圣公司）。

1.2 主要仪器 多功能酶标仪(美国BioTek 公司)；DMI6000B 荧光显微镜(德国Leica 公司)；Accuri C6流式细胞仪（美国BD 公司）；LightCycler96 实时荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）。

1.3 细胞株 人胃癌细胞株AGS、MKN28、SGC7901和MKN45 均由上海交通大学附属第一人民医院普外科实验室保存。所有细胞均使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。

实验分为AGS 空白对照组（AGS-CON）、AGS阴性对照组（AGS-Vector）、AGS 过表达组（AGS-HOXA13）；MKN28 空白对照组（MKN28-CON）、MKN28 阴性对照组（MKN28-Vector）、MKN28 过表达组（MKN28-HOXA13）；SGC7901 空白对照组（SGC7901-CON）、SGC7901 阴性对照组（SGC7901-Scramble）、SGC7901 敲减组（SGC7901-sh-HOXA13）；MKN45 空白对照组（MKN45-CON）、MKN45 阴性对照组（MKN45-Scramble）、MKN45敲减组（MKN45-sh-HOXA13），其中AGSHOXA13、MKN28-HOXA13、SGC7901-sh-HOXA13和MKN45-sh-HOXA13 为实验组。

1.5 Western blot 检测蛋白表达 加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液提取细胞蛋白，使用BCA 试剂盒测定浓度。通过10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，转印至PVDF 膜上。脱脂牛奶室温封闭1.5 h 后，（1∶1 000）、Tubulin（1∶1 000）一抗4℃孵育过夜。次日二抗室温孵育1 h 后，使用ECL 化学发光试剂盒显影检测蛋白表达水平。

1.6 药物敏感实验 胃癌细胞（5×103个/孔）接种于96孔板内，培养24 h 后，每孔加入不同浓度梯度（1.25M、2.5M、5M、10M、20M）的5-FU，或加入等体积的PBS。培养48 h 后，每孔加入经培养液稀释的CCK-8 试剂，37℃孵育2 h 后，测定450 nm 处的吸光度。通过吸光度计算各浓度5-FU 对胃癌细胞的抑制率，运用Logit 法计算各株胃癌细胞5-FU 的IC25和IC50。

1.7 CCK-8 实验 胃癌细胞（5×103个/孔）接种于96孔板内，37℃细胞培养箱中培养24 h 后，加入5-FU（AGS：6M、MKN28：6M、SGC7901：12M、MKN45：3M）或等体积的PBS。分别在0、24、48和72 h 加入经培养液稀释的CCK-8 试剂，37℃孵育2 h 后，测定450 nm 处的吸光度并绘制细胞生长曲线。

1.8 EdU 细胞增殖实验 胃癌细胞（1×104个/孔）接种于96 孔板内，培养箱培养24 h 后，每孔加入5-FU（AGS：6M、MKN28：6M、SGC7901：12M、MKN45：3M）。培养48 h 后，加入经培养液稀释的EdU 溶液。37℃孵育2 h 后，按照EdU 检测试剂盒说明书进行细胞固定和染色，通过荧光显微镜统计EdU阳性染色细胞数并计算EdU 阳性率。

1.9 流式细胞凋亡检测 将胃癌细胞（5×105个/孔）接种于6 孔板，培养箱培养24 h 后，每孔加入5-FU（SGC7901：12M、MKN45：3M）或等体积的PBS。培养48 h 后，用500L 结合缓冲液收集细胞悬液。按照Annexin V-PE/7-AAD 凋亡试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.10 二代测序分析 提取经5-FU 处理的AGS-HOXA13细胞和AGS-Vector 细胞的总RNA，进行文库构建后，使用Agilent 2200 检测仪检测。具体分析步骤参照相关文献[8]，二代测序技术由上海烈冰科技公司提供支持。

1.11 实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） Trizol 法提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒得到cDNA，使用SYBR Green Master Mix 进行实时荧光定量PCR（变性95℃、退火60℃、延伸60℃，循环40 次）。以作为内参，检测的mRNA 表达情况。及引物合成由中国上海生工生物公司完成。见表1。

表1 GAPDH和ABCC4引物序列

1.12 统计学分析 使用SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用独立样本 检验，＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

表2 药物敏感实验检测胃癌细胞5-FU 的IC25 和IC50 值（M）

3 讨论

CCK-8 实验评估胃癌细胞的生长情况，结果发现在实验组与对照组中，表达水平低下组的胃癌细胞经5-FU 处理后，生长速度最为缓慢。通过EdU实验发现, 与对照+5-FU 组相比，敲减+5-FU组的EdU 阳性率降低，提示低表达状态下，胃癌细胞对5-FU 较为敏感。抵抗化疗药物诱导凋亡是肿瘤细胞产生耐药的重要原因之一[14]。流式细胞实验发现表达下调后，5-FU对胃癌细胞SGC7901、MKN45 的凋亡诱导作用增强。提示表达抑制后会增强5-FU 的抗增殖作用，促进5-FU 诱导的细胞凋亡，增加胃癌细胞对5-FU 的敏感性。