游泳运动对大鼠实验性子宫内膜异位症的影响及机制分析*

景彦林， 杨修昭， 白振军， 贺千里

（1山西大同大学中医药健康服务学院，2大同市第五人民医院，山西大同037009）

子宫内膜异位症（endometriosis，EM）以子宫腔外子宫内膜组织生长为特征，常见症状是痛经、性交困难、慢性盆腔疼痛和不孕。证据表明，子宫膜异位症是由周期性出血的异位子宫内膜植入物导致［1］。因此，免疫因子可能与异位内膜细胞的生长和着床有关。而内环境变化可能影响炎症的发展和维持，从而与子宫内膜异位症发生过程相关［2］；另一方面，体育锻炼似乎对涉及炎症过程的疾病具有保护作用，如2型糖尿病和结肠癌［3］。体育锻炼也可增加某些激素结合球蛋白水平，降低雌激素生物利用度，并有益于雌激素依赖性疾病患者，如子宫内膜异位症患者［4］。此外，长期体育锻炼可使胰岛素抵抗降低，月经减少及具有抗炎特性的细胞因子增加［5］。尽管有证据表明体育锻炼对治疗子宫内膜异位症有益处，但迄今为止，文献中还未报道游泳运动能否预防子宫内膜异位症的发生或发展。因此，本项工作主要观察游泳运动对大鼠实验性子宫内膜异位症的影响，并对其机制进行探讨。

材料和方法

1 动物

80 只SPF 级雌性SD 大鼠（4 周）购于山西医科大学动物中心［SCXK（晋）2015-0001］，体重80～90 g。大鼠存放在12 h 光照和12 h 黑暗清洁环境中，温度为（22±1）℃，自由进食和饮水。80只大鼠随机分为8组：对照组、模型组（0组）、子宫内膜异位症诱导前轻度运动（light exercise，L-ex）组（每周游泳1 次）、中度运动（moderate exercise，M-ex）组（每周游泳3 次）和剧烈运动（intense exercise，I-ex）组（每周游泳5 次）及子宫内膜异位症诱导后轻度运动组（每周游泳1次）、中度运动组（每周游泳3 次）和剧烈运动组（每周游泳5次），每组均为10只大鼠。

2 实验仪器和试剂

PCR 仪（ABI）；RNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（Santa Cruz）；ELISA 检测试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；基因特异性引物由上海生工生物科技公司合成。

3 方法

3.1 大鼠子宫内膜异位症模型的制备 于造模前24 h，在大鼠皮下注射外源性雌激素乙烯雌酚0.1 mg/kg，促使大鼠子宫内膜处于同一变化周期。以戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于手术台上，沿腹中线剪开腹壁和腹膜（切口大约2～3 cm），进腹后在膀胱背侧找到大鼠“Y”字型子宫，游离子宫右侧，用丝线在近端离右子宫角1 cm 处结扎，远端离卵巢约2 cm 处结扎，同时结扎两端间的子宫系膜血管。剪取靠近卵巢处约1.5 cm 子宫置入含生理盐水培养皿中，肌层与子宫内膜层分离后，将内膜剪成5 mm×5 mm 大小与腹壁肌肉缝合固定［6］，如图1 所示。最后向大鼠腹腔撒少许青霉素钠，分层关闭腹腔，缝合切口。手术结束后每天腹腔注射青霉素，连续1周。术中无异常表现，术后造模大鼠无感染及死亡。4 周后再次开腹，观察建模是否成功，成功标准：移植灶体积增大，呈透明结节状或囊状，移植物被结缔组织覆盖并有血管形成。造模成功率大约为70.0%。用游标卡尺测量移植物病灶面积=长（mm）×宽（mm）。

Figure 1.Preparation of endometriosis model in rats.图1 大鼠子宫内膜异位症模型制备

3.2 游泳运动 有氧运动选择游泳，因为大鼠具有天生的游泳能力，并能很好地适应训练，因此游泳对大鼠来说压力较小。大鼠造模成功后24 h开始游泳适应，大鼠首先在0.9 m× 0.9 m×1.2 m 水箱中适应5 d。第1 天，将动物置于温度为34℃的5 cm 深水中15 min，然后水位持续升高，第5 天水位升高至50 cm，均不会沉底表明适应完成。然后开始有氧运动，游泳运动持续5 周，运动强度逐渐增加，从第1 周20 min 开始，到第5 周60 min 结束，运动后大鼠的主动运动减少。

3.3 样本收集及病变大小评估 运动结束后，采用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，收集5 mL 血液，用于氧化应激分析。然后打开盆腔，切除子宫内膜异位症病变部位进行组织学和基因表达分析。对侧子宫角（左角）也作为对照切除。样本固定在10%甲醛中，石蜡包埋处理，苏木精染色，确认异位子宫内膜组织的存在。为了计算病变面积的变化，再次用游标卡尺测量造模后运动组移植物病灶面积大小。

3.4 RT-qPCR 首先取大鼠异位子宫内膜总RNA，然后进行反转录反应，使用FAS、PCNA 和MMP9 特异性引物进行RT-qPCR 扩增。引物序列如下：FAS的上游引物序列为 5'-CAAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG-3'，下游引物序列为5'-TGTGAAAGTCCTGAACCCTAAGG-3'；MMP9 上游引物序列为 5'CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3'，下游引物序列为5'CCACCC GAGTGTAACCATAGC-3'；PCNA 上游引物序列为5'-GGAAATGGAAACATTTTAAATTGTCAC-3'，下游引物序列为5'-GAGTGGCTTTTGTAAAGAAGTTCAG-3'；β-actin 上游引物序列为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列为5'-AACGCTTOACGAATTTGCGT-3'。通过分析软件得到每组的Ct，其中β-actin作为内参照；参照文献报道的方法［7］，用 2-ΔΔCt法比较不同处理后基因相对表达的含量。

3.5 Western blot 提取各组大鼠异位子宫内膜蛋白，取 30 μg 进行 SDS-PAGE，然后转至 PVDF 膜上。经5%牛奶孵育1 h 后，用磷酸盐缓冲液洗膜3 次，每次 10 min。用兔源 FAS、MMP9和PCNA（1∶1 000）4℃孵育3 h，PBST洗3次，每次10 min。用PBST稀释山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗（1∶25 000），室温孵育1 h。PBST 洗3 次，每次5 min。利用化学发光扫描系统检测蛋白表达并摄片，采用Quantity One 图像分析软件对吸光度积值进行分析。

4 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计软件进行分析，数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析及Tukey's 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠病变大小比较

子宫内膜异位病变诱导前的游泳运动对子宫内膜异位症无预防作用，而诱导病变后的运动无论频率如何（每周1次或每周5次），均可显著降低子宫内膜异位症的病变大小（P＜0.05）；与每周运动1 次大鼠相比，以中等（每周3次）或剧烈（每周5次）运动的大鼠病变显著减小（P＜0.05），见图2和表1。

Figure 2.The effect of swimming on endometriosis.图2 模型制备后游泳对异位病灶的影响

表1 各组大鼠异位病灶面积比较Table 1.Comparison of total lesion areas in differenr groups（mm2.Mean±SD. n=10）

2 各组大鼠相关基因mRNA表达的比较

如表2 所示，诱导子宫内膜异位症后进行中度或剧烈游泳运动的大鼠子宫内膜FAS mRNA 表达均显著增加（P＜0.05）；而诱导子宫内膜异位症后进行中度或剧烈游泳运动的大鼠MMP9 mRNA 均显著降低（P＜0.05）。

表2 各组FAS、MMP9和PCNA mRNA表达Table 2.The mRNA expression of the FAS，MMP9 and PCNA at the end of the experimental protocol（Mean±SD. n=10）

3 各组大鼠相关蛋白表达比较

Western blot 结果进一步证实，诱导子宫内膜异位症后进行中度或剧烈游泳运动的大鼠其子宫内膜FAS 蛋白显著增加（P＜0.05）；而诱导子宫内膜异位症后进行中度或剧烈游泳运动的大鼠其子宫内膜MMP9和PCNA 蛋白均显著降低（P＜0.05），见图 3和表3。

Figure 3.Western blot was used to detected the protein levels of FAS，MMP9 and PCNA at the end of the experimental protocol.图3 FAS、MMP9和PCNA的Western blot结果

表3 各组FAS、MMP9和PCNA蛋白表达Table 3.Expression of the FAS，MMP9 and PCNA proteins at the end of the experimental protocol（Mean±SD. n=5）

讨 论

以往研究已经证实，规律体育锻炼对炎症相关疾病的患者具有保护作用［8］。近年研究发现，横纹肌具有内分泌功能，通过合成和释放收缩刺激心肌细胞因子，从而影响和改变组织和器官中的代谢及细胞因子产生［9］。对现有文献数据的分析表明，游泳运动能否预防子宫内膜异位症的发生或发展，以及游泳运动在多大程度上对子宫内膜异位症患者有益，仍不明确。由于对子宫内膜异位症的研究往往需要采用侵入性方法，这限制了其在临床上的应用，因此必须使用动物模型进行研究［10］。在此背景下，开海丽等［11］提出的大鼠子宫内膜异位症诱导实验模型广泛应用于相关研究，可有效地诱导病变，并具有高度的可重复性。此外，大鼠具有天生的游泳能力，能很好地适应训练［12］。基于这些原因，因而本研究通过游泳作为体育锻炼来评估其对子宫内膜异位症模型大鼠的影响。本研究结果表明，诱导大鼠子宫内膜异位症后，游泳运动至少在一定程度上有益于子宫内膜异位症的治疗，无论运动频率如何（每周1次或每周5 次），而大鼠子宫内膜异位症模型制备前的游泳运动对子宫内膜异位症的治疗无任何影响。因而本研究主要关注的是大鼠子宫内膜异位症模型制备后的游泳运动。

正常子宫内膜细胞凋亡呈周期性变化。本研究结果显示，在子宫内膜异位症诱导后进行游泳运动的大鼠FAS mRNA 水平显著增加。FAS 属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族成员之一，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。细胞在接收到经FAS 传递的凋亡信号后，主要通过外源性凋亡途径和内源性凋亡途径引发细胞凋亡［13］。子宫内膜异位症患者异位内膜功能活跃，黏附、侵袭、血管增生能力强，使其易于迁徙和种植，而凋亡相关基因的表达并不随月经周期出现波动，导致患者在位和异位内膜细胞对凋亡信号的敏感性减弱［14］，而游泳运动可使FAS mRNA 及蛋白水平增加，因而异位子宫内膜细胞凋亡增加，病变减小。本研究结果也显示，在子宫内膜异位症诱导后进行游泳运动的大鼠MMP9 和PCNA mRNA 水平显著降低。此外，Western blot 结果进一步证实，诱导子宫内膜异位症后进行游泳运动大鼠的PCNA 和MMP9 蛋白降低。MMP9 是金属基质蛋白酶家族中分子量最大的明胶酶，可促进血管内皮细胞出芽，导致新生血管形成，因而其在子宫内膜细胞的异位勃附、种植和生长过程中发挥重要作用［15］。因而MMP9 蛋白水平降低可使子宫内膜异位细胞的增殖、迁移和分化减少。PCNA 基因是反应细胞增殖的指标。PCNA 存在于细胞核中，是DNA 聚合酶δ的辅助蛋白，为DNA 复制所必需，可作为细胞增殖有效标志物［16］。本研究结果显示游泳运动可使PCNA 蛋白表达降低，可抑制大鼠异位子宫内膜细胞增生。

总之，本研究结果表明，造模后游泳运动可能通过调节FAS、MMP9 和PCNA 蛋白，从而对大鼠子宫内膜异位症发挥有益作用。