液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术检测牛奶中莫昔克丁残留

尹晖，王亦琳，叶妮，孙红洋，孙雷，王鹤佳

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

莫昔克丁(Moxidectin)属于米尔贝霉素类抗生素，主要用于动植物驱虫，具有广谱高效的驱虫活性和安全性[1]，目前临床上主要用于对牛[2-4]、羊[5-6]、猪、马和犬[7-9]、猫[10]等宠物的寄生虫防治。莫昔克丁用药量较少，对人畜和环境较为安全[11]，在动物组织、脂肪和粪便中的主要残留形式为莫昔克丁原形。随着莫昔克丁在兽医临床的广泛应用，随之产生的兽药残留和耐药性问题日益受到关注[12]。欧盟、美国、日本规定莫西克丁在牛奶中的最大残留限量(maximum residue limit,MRL)为40 μg/kg[13]，我国也规定了牛奶中莫昔克丁的MRL为40 μg/kg[14]。目前牛奶中莫昔克丁残留检测方法的报道较少[15-17]，其他动物组织中的莫昔克丁残留检测方法多为液相色谱法[18-20]，我国也没有牛奶中莫昔克丁残留检测方法的国家标准，因此建立一个准确、高效的检测方法，对动物性食品中莫昔克丁残留监控具有重要参考意义。

三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术(QTRAP)在四极杆的高灵敏度基础上，增加了线性离子阱增强子离子扫描的定性功能，可以同时得到用于定性定量的MRM谱图和用于进一步定性的EPI二级谱图，大大提高了痕量药物定性的准确度[21]。本研究采用MRM-IDA-EPI模式，在检测牛奶中莫昔克丁残留时提供了残留标志物的EPI指纹图，进一步提高了定性的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备 Shimadzu 30A-QTRAP 6500液相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司-美国AB SCIEX公司；XS105DU分析天平，Mettler Toledo公司；AE260电子天平，Mettler Toledo公司；Biofuge Strators高速冷冻离心机，贺利氏公司；SIR4涡旋混合器，IKA公司；氮吹仪，Jnc公司。

1.2 药品和试剂 莫昔克丁，纯度≥98.0%，购自北京振翔科技有限公司；甲酸、乙腈为色谱纯，均购自MERCK公司；所用水为超纯水。

1.3 对照溶液配制 精密称取莫昔克丁标准品适量，置于10 mL棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液；量取标准储备液适量，用乙腈稀释成10 μg/mL的标准工作液，再用50%乙腈水溶液稀释成100 ng/mL的标准工作液。

1.4 测定方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)，流动相A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相梯度洗脱条件见表1，柱温30 ℃，进样量5 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)，采用多反应监测-信息依赖扫描-增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)方式采集，电喷雾电压(IS)为5500 V，离子源温度为550 ℃，气帘气(CUR)为25 psi，碰撞气(CAD)为高等(High)，辅助气(GS1)为50 psi，辅助气(GS2)为50 psi；IDA参数：动态背景扣除，从不排除之前的目标离子，触发阈值100 cps；EPI参数：扫描范围为100～650m/z，扫描速度10000 Da/s，CE为35 eV，CES为15 eV。待测药物定性定量离子对及对应的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)见表2。

表2 莫昔克丁定性定量离子对及对应的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)Tab 2 Qualitative ions,corresponding quota ions of Moxidectin and corresponding declustering potential(DP),collision energy(CE)

1.4.3 定性与定量 定性时试样溶液中色谱峰的保留时间，应与校正溶液的保留时间一致，容许偏差为±5%，试样溶液中的离子丰度比应与校正溶液的一致，容许偏差符合欧盟2002/657/EC决议要求。线性离子阱获得增强离子扫描(EPI)谱图，应与校正溶液的EPI谱图匹配。定量方法采用外标法定量。

1.4.4 基质匹配标准曲线绘制 精密量取莫昔克丁标准工作液适量，用50%乙腈水溶液稀释成浓度为1、2.5、5、10、20、40和80 ng/mL的系列标准工作液，从中各取1.0 mL，分别加入到空白牛奶试料经提取、净化和吹干后的残余物中，充分溶解，过滤，过0.2 μm滤膜后，作为基质匹配标准溶液上机测定。按所得峰面积与相应的对照溶液浓度作标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

1.4.5 样品前处理过程 称取牛奶(2±0.02)g于50 mL离心管中，加乙腈6 mL，涡旋后中速水平振荡5 min，10000 r/min离心5 min，转移上清液至另一50 mL离心管中，加水10 mL，混匀，备用，C18固相萃取柱依次用乙腈5 mL和洗涤溶液5 mL活化，取备用液9 mL过柱，用洗涤溶液5 mL淋洗，抽干，用乙腈5 mL洗脱，收集洗脱液于10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干。用50%乙腈水溶液1.0 mL溶解残余物，充分溶解，过微孔滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4.6 方法灵敏度确定 将适量莫昔克丁标准工作液加入到空白牛奶中，经上述方法进行前处理后，用UPLC-QTRAP检测，观察药物特征离子质量色谱峰信噪比(S/N)和对应药物浓度，S/N>10者为方法的定量限。

1.4.7 准确度和精密度的测定 采用标准添加法，在空白牛奶试料中分别添加2、40、80 μg/kg三个不同浓度药物进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间RSD。

2 结果与分析

2.1 定性分析 本研究使用MRM-IDA-EPI扫描模式，当MRM通道采集的信号超过100 cps时触发EPI增强离子扫描，在保留时间2.47 min左右获得3个不同碰撞能量(20、35、50 eV)的EPI谱图，得到更多子离子信息。将空白牛奶添加试样和莫昔克丁标准溶液的EPI谱图进行比对，得到10个匹配的子离子，表明本方法定性高度准确。莫昔克丁基质匹配标准溶液和空白牛奶添加试样的EPI谱图见图1-图2。

图1 莫昔克丁基质匹配标准溶液的EPI谱图Fig 1 EPI(Enhanced Product Ion)of Moxidectin in matrix-matched standard solution

图2 空白牛奶添加莫昔克丁试样的EPI谱图Fig 2 EPI(Enhanced Product Ion)of Moxidectin in milk spiked samples

2.2 基质匹配标准曲线 按照上述系列基质匹配标准溶液浓度进行线性回归，得到的回归方程及相关系数见表3。从表中可以看出，牛奶中莫昔克丁在1～80 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，R2大于0.990。

表3 牛奶中莫昔克丁基质匹配标准曲线Tab 3 Matrix-matched standard curve of Moxidectin in milk

2.3 方法灵敏度 按上述方法进行处理，当添加浓度为2 μg/kg时，测得莫昔克丁的S/N>10，说明方法定量限为2 μg/kg。2 μg/kg空白牛奶添加试样中莫昔克丁的特征离子质量色谱图见图3。

1.莫昔克丁(640.4>498.2);2.莫昔克丁(640.4>528.2)1.Moxidectin(640.4>498.2);2.Moxidectin(640.4>528.2)图3 空白牛奶添加试样溶液中得到的特征离子质量色谱图(2 μg/kg)Fig 3 Qualitative ions of Moxidectin in milk(2 μg/kg)

2.4 方法精确度 在空白牛奶中添加低、中、高三个不同浓度的莫昔克丁进行回收率试验，结果汇总见表4。可以看出，空白牛奶中莫昔克丁在2～80 μg/kg添加浓度范围内的回收率为76.8%～115%，批内、批间RSD均<15%。

表4 空白牛奶中莫昔克丁添加回收试验结果Tab 4 Recoveries of Moxidectin in milk spiked samples

3 讨论与结论

3.1 提取和净化 本方法称取牛奶样品2 g，加入3倍体积的乙腈6 mL进行提取，然后通过高速离心去除蛋白质等大量杂质的干扰，有效地提取莫昔克丁药物残留。固相萃取法是常见的净化方式，莫昔克丁可采用反相C8[15]或C18固相萃取柱净化，经过比较试验，本研究采用C18固相萃取柱净化，可以有效吸附脂肪及其他杂质，去除牛奶样品中的大部分基质干扰。在不影响回收率的情况下尽可能减少过柱体积，取一半备用液过柱，不仅能够有效降低基质效应，还能节约过柱时间，为实际应用中大批量样品检测提供了便捷。

3.2 定性分析 根据欧盟2002/657/EC要求，要确证莫昔克丁至少需要3个识别点(IP)，因此在大多数检测方法中，采用MRM扫描模式，选定母离子及对应的两个响应较强的子离子作为定性定量依据，母离子是1个IP点，两个子离子分别是1.5个IP点，共4个IP点，足以达到检测方法要求。本研究中，采用QTRAP质谱仪特有的MRM-IDA-EPI扫描模式，当MRM通道采集的信号超过100 cps时触发EPI增强离子扫描，在保留时间左右获得更多子离子的信息，得到莫昔克丁的特征性EPI谱图，将空白牛奶添加试样和莫昔克丁标准溶液的EPI谱图进行比对后，得到母离子和10个匹配的子离子，共16个IP，极大地提高了定性的准确度。

本方法利用液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术建立了牛奶中莫昔克丁的残留检测方法，定性、定量准确，前处理方法简捷，由于EPI谱图具有很强的特异性，极大提高了定性的准确度，可以作为牛奶中莫昔克丁残留检测的确证方法，为动物性食品中兽药残留监控工作提供了重要的技术支持。