鸡组织中多西环素残留量测定的高效液相色谱法建立

张青，李慧素，吴宁鹏，彭丽，吴志明*

(1.河南农业大学动物医学院，郑州 450002；2.河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

多西环素(Doxycycline)是由链霉菌产生的四环素类抗生素，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有抑制作用，具有高效、广谱、长效等优点，在兽医临床中被广泛用于防治畜禽支原体病、大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病、布氏杆菌病及细菌引起的呼吸道感染等疾病[1]。然而，在养殖业生产中存在超剂量、超范围等不合理使用和不遵守休药期的现象，造成了耐药菌株的出现和畜禽产品中药物残留超标的问题。多西环素在动物源食品中残留，会对人体的肝脏、牙齿和骨骼等造成损害，给人类的健康造成潜在危害[2-3]。因此，我国和欧盟均规定多西环素在家禽组织中最大残留限量(Maximum residue limit,MRL)为100～600 μg/kg[4]。目前，国内外关于多西环素药物残留检测主要是水产品、牛奶[5]、鸡蛋[6]及部分家畜的肌肉[7]、肝脏组织[8]中残留量测定，未见肾脏和皮+脂组织中多西环素残留量测定方法的报道，现有的标准方法中组织也涵盖不全。本研究旨在建立一种高效液相色谱法，可以同时测定鸡的肌肉、肝脏、肾脏和皮+脂等组织中多西环素残留量，以期为全面监控鸡组织中多西环素残留提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器 高效液相色谱仪Waters 2695，配Waters 2487检测器，美国Waters公司；台式冷冻高速离心机，美国Sigma公司；电子天平(感量0.00001 g和0.01 g)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；IKA MS3 basic漩涡仪，艾卡(广州)仪器设备有限公司(IKA中国)；Milli-QA10 超纯水仪，美国MiLipore 公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪，美国Organomation Associates公司；固相萃取装置，美国Waters公司；微量加样器：美国Eppendorf 公司。

1.2 试剂与材料 多西环素对照品，含量：85.2%，批号：K0131507，中国兽医药品监察所提供。甲醇和乙腈，色谱纯，均购自德国Merck公司；三氟乙酸、二氯甲烷、乙二胺四乙酸二钠、枸橼酸、磷酸氢二钠、草酸、硫酸、钨酸钠等，均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。HLB固相萃取柱(6cc，500 mg)，购自美国Waters公司。定性滤纸(快速)，购自杭州沃华公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 1 mg/mL多西环素标准贮备液 准确称取相当于多西环素10 mg的多西环素对照品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1 mg/mL的多西环素标准贮备液，于-20 ℃以下保存，有效期1个月。

1.3.2 10 μg/mL多西环素标准工作液 准确量取1.3.1项下溶液1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为10 μg/mL的多西环素标准工作液，现用现配。

1.3.3 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液 分别取一水柠檬酸12.9 g，十二水磷酸氢二钠27.6 g，二水乙二胺四乙酸二钠37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.0，加水稀释至1000 mL，混匀。

1.3.4 0.01 mol/L草酸溶液 取草酸1.26 g，用水溶解并稀释至1000 mL。

1.3.5 30%甲醇草酸溶液 取甲醇30 mL，加0.01 mol/L草酸溶液稀释至100 mL。

1.3.6 0.34 mol/L硫酸溶液 取硫酸1.85 mL，用水溶解并稀释至100 mL。

1.3.7 7%钨酸钠溶液 取钨酸钠7 g，用水溶解并稀释至100 mL。

1.3.8 0.01 mol/L三氟乙酸水溶液 取三氟乙酸0.8 mL，用水溶解并稀释至1000 mL，配制成0.01 mol/L三氟乙酸水溶液。

1.4 试验方法

1.4.1 样品前处理 肌肉、肝脏和肾脏：称取试料5.0 g于50 mL离心管中，加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液20 mL，涡旋1 min，振荡10 min，加0.34 mol/L硫酸溶液5 mL、7%钨酸钠溶液5 mL，涡旋1 min，8500 r/min离心5 min，取上清液。残渣分别加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液20 mL和10 mL，涡旋1 min，振荡10 min，8500 r/min离心5 min，重复提取两次。合并三次上清液，滤纸过滤后，备用。

皮+脂：称取试料5.0 g于50 mL离心管中，加二氯甲烷15 mL，涡旋1 min，振荡5 min，加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液15 mL，涡旋1 min，振荡5 min，8500 r/min离心5 min，取上层溶液。下层溶液加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液15 mL萃取，取上层溶液，重复两次。合并三次上层溶液，滤纸过滤后，备用。

HLB柱依次用甲醇5 mL、水5 mL和Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液5 mL活化，取备用液过柱，待全部备用液流出后，依次用水10 mL、5%甲醇溶液10 mL淋洗，抽干，用甲醇6 mL洗脱，收集全部洗脱液于刻度试管中，抽干，于40 ℃水浴氮气吹至约1.0 mL，用0.01 mol/L草酸溶液定容至2.0 mL，过滤，供高效液相色谱测定。

1.4.2 色谱条件 色谱柱：Waters Xbrige C18柱(150 mm×4.6 mm，粒径5 μm)；流动相A：0.01 mol/L三氟乙酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脱，见表1；检测波长：350 nm；进样量：50 μL；柱温：30 ℃。

表1 流动相梯度洗脱Tab 1 Mobile phase compositions for gradient elution

1.4.3 标准曲线的绘制 准确量取多西环素标准工作液适量，用30%甲醇草酸溶液稀释成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的系列标准溶液，从低浓度到高浓度依次进样，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

1.4.4 检测限与定量限 按1.4.1项样品前处理方法处理样品，再按1.4.2项液相色谱条件进行分析测定。依照信噪比S/N≥3为检测限(Limit of detection,LOD)，S/N≥10为定量限(Limit of quantification,LOQ)。

1.4.5 精密度与准确度 取空白鸡组织样品，以定量限和最大残留限量为依据，添加4个不同浓度(LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL)的多西环素标准溶液，按1.4.1项样品前处理方法处理样品，再按1.4.2液相色谱条件进行HPLC分析测定，每个浓度5个平行样品，进行3次重复试验。求回收率和批内、批间变异系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 在0.05～5 μg/mL的浓度范围内，多西环素色谱峰面积与浓度呈线性相关，回归方程为y=81.63x+22461.60，权重是1/x2，相关系数r大于0.999，见图1。

图1 多西环素标准曲线图Fig 1 Standard curve of doxycycline solution

2.2 检测限与定量限 按照信噪比S/N≥3为检测限，S/N≥10为定量限，求得鸡各组织中多西环素的检测限分别为肌肉20 μg/kg，肝脏、肾脏和皮+脂50 μg/kg；定量限分别为肌肉50 μg/kg，肝脏、肾脏和皮+脂100 μg/kg，色谱图见图2～图10。

图2 多西环素标准溶液色谱图(100 μg/L)Fig 2 Chromatogram of doxycycline standard solution(100 μg/L)

图3 鸡肉组织空白色谱图Fig 3 Chromatogram of blank chicken muscles

图4 鸡肉组织空白添加50 μg/kg多西环素色谱图Fig 4 Chromatogram of doxycycline 50 μg/kg added in chicken muscles

图5 鸡肝脏组织空白色谱图Fig 5 Chromatogram of blank chicken livers

图6 鸡肝脏组织空白添加100 μg/kg多西环素色谱图Fig 6 Chromatogram of doxycycline 100 μg/kg added in chicken livers

图7 鸡肾脏组织空白色谱图Fig 7 Chromatogram of blank chicken kidneys

图8 鸡肾脏组织空白添加100 μg/kg多西环素色谱图Fig 8 Chromatogram of doxycycline 100 μg/kg added in chicken kidneys

图9 鸡皮+脂组织空白色谱图Fig 9 Chromatogram of blank chicken skin with fat

图10 鸡皮+脂组织空白添加100 μg/kg多西环素色谱图Fig 10 Chromatogram of doxycycline 100 μg/kg added in chicken skin with fat

2.3 精密度与准确度 从表2～表5可以看出，多西环素在肌肉组织50 ～200 μg/kg添加浓度范围，平均回收率为63.42%～81.11%，批内变异系数为2.2%～9.9%，批间变异系数为5.7%～9.0%；在肝脏组织100 ～600 μg/kg添加浓度范围，平均回收率为62.32%～84.92%，批内变异系数为1.2%～11.5%，批间变异系数为6.3%～9.0%；在肾脏组织100 ～1200 μg/kg添加浓度范围，平均回收率为90.40%～90.90%，批内变异系数为1.5%～13.5%，批间变异系数为5.0%～14.1%；在皮+脂组织100 ～600 μg/kg添加浓度范围，平均回收率为70.77%～74.6%，批内变异系数为0.7%～6.8%，批间变异系数为1.4%～4.8%。

表2 鸡肉中添加多西环素的回收率测定结果Tab 2 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken muscles

表3 鸡肝脏中添加多西环素的回收率测定结果Tab 3 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken livers

表4 鸡肾脏中添加多西环素的回收率测定结果Tab 4 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken kidneys

表5 鸡皮+脂中添加多西环素的回收率测定结果Tab 5 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken skin with fat

3 讨论与结论

3.1 方法的选择 目前国内外多西环素残留检测方法常用的有酶联免疫法(ELISA)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱法(HPLC)等。其中，ELISA法操作简单、省时、灵敏度高，但存在一定的交叉反应，易出现假阳性[9-10]，结果需要其他方法进行确证；液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、特异性强[11-13]的特点，但存在基质效应、前处理操作复杂、定量不准等问题，在实际应用中受到一定的限制；高效液相色谱法具有简单、快捷、准确等特点[14-16]，是目前四环素类药物分析检测最普遍的方法，而高效液相色谱-紫外检测法是中国兽药典、多项国家标准及行业标准常用的方法，也是多西环素药物检测中最经典的方法。因此，选择高效液相色谱-紫外检测法测定鸡组织中的多西环素残留量，提高了方法的灵敏度、准确度和重现性，为控制可食性鸡组织中多西环素的残留提供可靠的方法保证。

3.2 色谱条件的优化 通过比较常用的甲醇-乙腈-草酸、三氟乙酸-甲醇、三氟乙酸溶液-乙腈等四环素类药物测定流动相体系，发现0.01 mol/L三氟乙酸溶液-乙腈作为流动相，梯度洗脱，可避免多西环素色谱峰展宽和出峰较早易受到杂质峰干扰等问题。同时，采用多西环素两个最大吸收波长270 nm和350 nm进行考察，发现选择350 nm为检测波长，可避免样品中杂质对多西环素的干扰，同时可获得较高的响应值，提高方法的灵敏度。

3.3 固相萃取柱的选择 组织中的多西环素用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液提取，造成样品提取液中存在较多的极性杂质，与多西环素极性相似，进一步净化时不能用液-液分配方法进行净化。故分别选择HLB、C18、MAX、HLB-PRS、HLB-COOH等固相萃取柱进行考察。结果发现，C18柱和HLB柱二者均能较好的净化样品，但C18柱在使用时会因吸附剂干涸、pH值等问题造成结果重现性差。因此，本方法采用HLB固相萃取柱进行净化处理，有效去除蛋白和内源性杂质，减少了杂质干扰，提高了方法的准确度和精密度。

3.4 皮+脂组织提取方法优化 由于多西环素具有较强的极性，采用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液直接提取皮+脂组织中的多西环素时，容易出现提取不完全、回收率低等问题。参考相关文献[17]，选择非极性溶剂将脂肪组织溶解，再用液-液萃取法进行反相萃取。通过比较叔丁基甲醚、正己烷、乙腈、丙酮和二氯甲烷等有机溶剂，发现二氯甲烷可以将脂肪组织充分溶解，再用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液反相萃取两次，才能将皮+脂组织中多西环素完全萃取至缓冲溶液中，从而提高提取效率，准确测定皮+脂组织中多西环素的残留量。

本文建立了高效液相色谱法测定鸡四种组织中多西环素残留量的方法，特异性强，准确度高，精密度好，可满足鸡组织中多西环素残留量的检测，为动物性食品中多西环素残留监控提供了检测依据。