植物Dof基因结构特点及功能研究进展

刘俊 金钰 吴耀松 刘燕 王文彬 任闪闪 刁松锋 陈玉龙

（1. 河南中医药大学 中医药科学院 河南省中医方证信号传导重点实验室，郑州 450046；2. 河南省林业科学研究院，郑州 450008；3. 中国林业科学院经济林研究所 国家林业和草原局泡桐研究开发中心 经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，郑州 450003）

转录因子又称反式作用因子，是一类能够专一性结合目的基因上游特异核苷酸序列，并具对靶基因有激活或抑制功能的一类含有特殊结构的蛋白。根据转录因子对其他基因的调控关系，植物的反式作用因子可以分为两类，一类可以非选择性地调控基因的转录表达，称之为非特异性转录因子；另一类可以特异性调控下游因子的转录翻译。根据转录因子结合域的类型分为不同的基因家族，同时依据保守域的数目及保守域外的功能域，基因家族又分为不同的亚家族［1-2］，如Dof、MYB、MADS、LBD、SAUR、GRF、bHLH、KNOX、WRKY和NAC转 录因子家族等。

1 Dof转录因子在植物基因组中的分布

ZmDof1是第一个从玉米中克隆出来的Dof基因［3］，随着人们对转录因子的关注和深入研究，更多的Dofs基因从其他物种的基因组数据库中相继被预测或克隆出来。随着基因组学和分子生物学的发展，无论是在高等植物还是在单细胞藻类中发现均有Dof转录因子家族，但是不同物种中数量差异较大。本文对已报道的不同物种中Dof转录因子的数目进行了统计，结果如表1所示。

2 Dof转录因子的结构特点

DNA结 合 单 锌 指（DNA binding with one zinc finger，Dof）蛋白是植物特有的转录因子家族之一，属于C2C2单锌指蛋白超家族，因富含一个特别的Cys残基的单锌指保守结构域，称为Dof结构域［37］。Dof蛋白通常由200-400个核苷酸残基组成，只含有一个拷贝的Dof保守域和两个结构域组成，N末端高度保守的DNA结合结构域和C尾端转录调控域［2，38-41］。结合结构域（Binding domain，BD）是一段高度保守的，由52个氨基酸残基组成的Dof结构域，在此结构域中CX2CX21CX2C基序形成一个单锌指结构，单锌指结构中4个保守的Cys残基与1个Zn2+共价结合［2，42-44］，一个发生变化，均会导致Dof蛋白活性的丧失，DNA结合结构域能与其他蛋白结合，发生相互作用，是具有重要作用的功能域［45］。由于Dof蛋白的DNA结合域序列保守性较强，所以它们都有着相似的DNA结合特性［46］。C端包含一个具有多种功能的转录调控结构域，能与多种调控蛋白相互作用和激活基因表达［26］，该结构域氨基酸保守性较差，不同Dof成员之间变异很大，进而导致Dof蛋白功能的多样性。Dof蛋白的N端和C端区域可与多种调控蛋白或拦截信号相互作用，激活或抑制下游调控因子［47-48］。

表1 不同物种中Dof基因的分布［4］

3 Dof 转录因子的功能

Dof蛋白是只存在于植物体内的一类反式作用因子［49］，拥有丰富的功能。研究表明，Dof转录因子参与植物的生长调控、信号传导、种子萌发、光周期响应、非生物胁迫及开花调控等多种生物学途径［50-55］。

3.1 生长发育

Dof蛋白参与植物的多种生长发育［56］。在拟南芥中，OBP结合蛋白1（OBF binding protein 1，OBP1）蛋白作为Dof转录因子家族成员之一，是首先被报道出来的OCS元件结合因子（OCS element binding factor，OBF），OBP1的过表达导致了细胞周期相关基因显著上调表达，染色质免疫沉淀实验证实，OBP1的直接靶点至少包括核心细胞周期基因CYCD3；3和复制特异性转录因子基因AtDOF2.3；OBP1在细胞培养中的短期激活影响了细胞周期的重新进入，缩短了G1期的持续时间和细胞周期的总长度，OBP1组成性过表达则影响了细胞的大小和细胞数量，导致植株矮化；在胚胎发生、萌发和侧根起始阶段的表达表明，OBP1在细胞周期的重新进入中起着重要的作用，是关键细胞周期基因的转录调控因子［57］。过表达AtDOF5.4/OBP4通过促进内循环的早期发生，抑制细胞的扩增，降低了转基因拟南芥细胞的大小和数目，导致转基因植株矮小。因此，OBP4（OCS element binding factor，OBF4）作为一个负调控因子，调节拟南芥细胞的扩张和细胞周期进程［58］，并且OBP4通过与根毛缺陷型RSL2（ROOT HAIR DEFECTIVE6-LIKE2）基因的启动子结合，抑制RSL2的转录，有助于抑制拟南芥根毛依靠脱落酸（Abscisic acid，ABA）的生长［59］。AtDof2.4启动子在叶片原核、根和胚的原形成层细胞中均有活性，而AtDof5.8启动子活性在幼苗叶片原核、发育胚胎的子叶和发育花芽的维管组织的前缘静脉细胞中均有特异性表达，表明AtDof2.4和AtDof5.8在拟南芥不同生长发育过程中发挥不同作用［42，60］；AtDof6的转录水平在干燥的种子中积累，在催熟和种子吸胀时逐渐衰减。研究表明，AtDof6对种子萌发起负调控作用，ABA超敏表型以及ABA生物合成基因ABA1和ABA相关胁迫基因的表达增加，酵母双杂交和双分子荧光互补实验结果显示，AtDof6可以与种子萌发阳性调节因子TCP14发生蛋白互作。在TCP14突变体中，ABA1和与ABA相关的应激基因的表达也增强，表明AtDof6对种子萌发起负调控作用，并与TCP14对一组特定的ABA相关基因的调控功能相违背［61］。AtDof5.6/HCA2（high cambial activity 2）优先在各器官的维管系统中表达，尤其在花序茎的形成层、韧皮部和束间薄壁细胞中，进一步研究表明，HCA2促进束间形成层在花序梗发育的早期阶段形成。由此表明AtDof5.6/HCA2参与了拟南芥束间形成层的形成和维管组织发育的调控［62］；AtDof4.7基因在拟南芥的长角果和里层中丰富表达，过表达AtDof4.7基因导致翼瓣和雄蕊的脱落时间明显推迟，进而影响花器官的脱落［2］，表明AtDOF4.7作为转录复合物的一部分参与脱落的控制，直接调控细胞壁水解酶的表达［63］；Dof2.1通过MYC2-Dof2.1-MYC2前馈转录环作为JA诱导叶片衰老的增强剂，促进拟南芥叶片衰老［64］。在小麦中，Dof转录因子小麦醇溶一谷蛋白盒结合因子（Wheat prolamin-box binding factor，WPBF）是从小麦胚乳中分离到的一种DOF转录因子，蛋白质体外结合实验和双分子荧光互补实验结果证明，WPBF可以与TaQM发生相互作用，并且TaQM的表达模式与WPBF相似；在转基因拟南芥的种子和维管系统中观察到了WPBF基因的启动子活性，这与WPBF在小麦中的表达谱一致。由此表明，WPBF不仅在小麦种子发育过程中起作用，在其他生长发育过程中也起作用，具有功能的多样性［65］。番茄中，SlDOF10参与维管组织的发育，并且在生殖发育过程中发挥重要作用［66］；SlDof1在高度富含保卫细胞的表皮中表达，凝胶阻滞实验显示，SlDof1能够与特异的TAAAG基序相互结合，该结果为TAAAG元件是调控细胞特异性基因表达的Dof蛋白的靶位点提供了证据［67］。超表达35S∷SlCDF3通过提高光合作用和糖的利用，提高了转基因番茄植株的生物产量，转录组分析显示，CDF3（CYCLING DOF FACTOR 3）基因参与调控氧化还原稳态、光合作用性能和初级代谢相关基因的表达，进而提高生物产量［68］。在大豆中，过表达GmDof11显著增加了转基因植株的分枝数、主茎节数和百粒重，并提高了种子含油量及大豆的产量［42，69］。OsDof24和OsDof25能够调节水稻种子中贮藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的表达［70］；过表达OsDof12减少转基因水稻主支和侧支的数目、降低植株高度、叶片直立变短、小穗长度变小。由此说明，OsDof12参与水稻植株结构的形成［71］。

3.2 碳氮代谢

在玉米中，ZmDof1（MNB1a）不仅诱导磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenol pyruvate carboxylase，PEPC）和正磷酸双激酶（cyPPDK）基因的表达，调控氮的代谢［41，72］，而且超表达ZmDof1导致转基因拟南芥氮含量提高30%［44］；过量表达ZmDOF36导致转基因玉米淀粉结构异常，淀粉合成相关基因上调表达，玉米淀粉含量增加，可溶性糖和还原糖含量降低，酵母单杂交结果显示，ZmDOF36可以直接调控ZmAGPS1a、ZmAGPL1、ZmGBSSI、ZmSSIIa、ZmISA1和ZmISA3基 因 转 录［73］；ZmDof3在 体 内外均可与淀粉生物合成基因Du1和Su2启动子中的Dof核心元件结合。进一步分析表明，ZmDof3的敲除降低了参与糊粉细胞分化的Nkd1的表达，ZmDof3可以与Nkd1启动子的Dof核心元件结合，表明ZmDof3在玉米胚乳发育过程中起着正向调节作用，在调控淀粉积累和糊粉蛋白发育的信号系统中起着积极的调节作用［74］。OsDof13是ZmDof1的同源基因，该基因也参与低氮胁迫响应［37］，OsDOF18通过诱导水稻根系中氨转运体来控制植株对氨的吸收［75］。豌豆中，PsDof7基因参与碳代谢，在葡萄糖处理下该基因上调表达［76］。在甘薯中，超量表达Dof类转录因子SRF1通过对液泡转化酶基因的负调控，调节贮藏根的碳水化合物代谢，增加淀粉鲜重在转基因植株中含量，显著降低了葡萄糖和果糖所占比重［41，77］。综上所述，Dof转录因子在植物碳氮代谢中发挥了重要作用。

3.3 非生物胁迫

大量研究表明，Dof转录因子参与植物的非生物胁迫等抗性反应［47，78］。在拟南芥中，MeJA诱导AtDof1.1基因的表达，表达量上调2-3倍［79-80］，ATDOF5.8通过调控质膜结合NAC蛋白ANAC069来参与盐胁迫响应［81］，CDF3基因的表达受高盐、干旱、高温和ABA的诱导，过表达CDF3提高转基因拟南芥干旱、低温和渗透胁迫的耐受程度，缩短转基因植株的开花时间。然而，缺失表达CDF3（cdf3-KO）引起转基因植株抗性减弱，CDF3可以调控细胞渗透和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）稳态相关基因表达，通过多跨膜结构蛋白GI（GIGANTEA）调节应答植物中糖和氨基酸水平的变化，由此说明，拟南芥CDF3基因在非生物胁迫中发挥了多重作用［82］。在番茄中，SlCDF1-5是拟南芥CDFs的同源基因，在干旱、盐、热和低温处理后，出现不同程度的上调表达，表明SlCDF1-5参与非生物胁迫响应；将SICDF1和SICDF3转入拟南芥，提高了转基因植株的抗旱能力［83］。二穗短柄草中，BdCBF1、BdCBF2和BdCBF3通过调节下游靶基因Dhn5.1（DEHYDRIN5.1）和冷相关COR（COLDREGULATED），在寒冷、干旱和盐胁迫中发挥重要作用［84］。TaDofs参与小麦颗粒发育及非生物胁迫响应，TaDof16、TaDof26和TaDof96在干旱胁迫处理下分别上调2倍、7倍和12倍［85］；在大白菜中，大部分的BraDofs基因的表达受到冷、热、高盐度和干旱胁迫的诱导。过表达GhDof1转基因棉花的耐盐性和耐寒性明显高于野生型，盐胁迫促进GhDof1超表达植株根系的生长，应激反应基因GhP5CS、GhSOD和GhMYB在转基因株系中的表达水平均有不同程度的上调，部分转基因植株油含量增加，蛋白质含量降低，表明GhDof1是提高陆地棉非生物胁迫耐受性和籽油含量的功能转录因子［86］。在杨树中，7个基因（PtrDof14、16、25、27、28、37和39）在ABA和渗透胁迫下，在叶片和根中持续上调表达，PtrDof27和PtrDof28在ABA处理中的叶片和根组织中，与拟南芥的同源基因（AT5G66940）具有相似的表达模式，表达量均得到了提高［87］。在刚毛柽柳中，ThDof1.4通过提高脯氨酸水平，增强ROS的清除能力，同时调控ThSODs、ThPODs、ThP5CS1和ThP5CS2基因的表达，显著提高了转基因植株非生物胁迫耐受性［88］。

3.4 开花调控

Dof转录因子还参与植物开花五大调控途径中的光周期途径。在拟南芥中，AtCDFs是开花抑制因子，该基因的表达受光周期的影响［2］。AtCDF1通过与开花诱导因子CO（CONSTANS）和成花基因FT（FLOWERING LOCUS T）启动子中的特异位点结合，抑制CO和FT基因的转录，导致AtCDF1转基因拟南芥开花延迟，然而在长日照条件下，泛素蛋白FKF1（F-BOX 1）与多跨膜结构蛋白GI（GIGANTEA）形成GI-FKF1（GIGANTEA-FLAVINBINDING，KELCH REPEAT，F-BOX1）蛋白复合体，抑制AtCDF1基因的转录，将AtCDF1从CO的启动子区域解除下来，进而促进开花［2，89-91］。AtDof4.1作为一个转录抑制因子，延迟拟南芥开花，并且抑制生殖器官发育，叶片、花和角果变小［55］。在水稻中，OsDofs在抽穗期发挥调控作用，存在基因冗余现象［92］；OsDofs参与光周期响应，黑暗抑制OsDof12基因表达，光照诱导表达，在长日照（LDs）条件下，超表达OsDof12显著降低转基因水稻开花时间，下游基因Hd3a（Heading date3a）和OsMADS14（MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRF14）上调表达，推测OsDof12基因通过直接或间接调节Hd3a和OsMADS14基因的表达，进而改变水稻开花时间［93］。干扰水稻昼夜波动OsRdd1（Rice Dof daily fluctuations 1）基因后，延长干扰植株的开花时间，并且水稻种子颗粒大小和千粒重均显著减小［2，94］。超表达SlCDF3抑制转基因拟南芥株系中CO和FT基因的表达，导致转基因植株开花延迟［83］。CDF1-CDF3、CDF5基因的表达受光周期的调控，在光周期开始时表达量最高，处理16 h-20 h时转录水平降为最低值，在黎明时升高［95］。在麻风树中，JcDof1和JcDof3基因在持续光照条件下，呈现出昼夜振荡表达模式，并受蓝光和红光的影响，JcDof3可以与F-box发生体外蛋白互作，调节光周期开花［42，96］。在番茄中，SlCDFs基因也参与光周期响应，其中，SlCDF1和SlCDF3在光周期起始阶段表达量最高，然而，SlCDF2、SlCDF4和SlCDF5在夜晚表达量达到峰值［83］。在多年生多次开花的杨树中，PttCDFs基因与拟南芥的AtCDFs具有相似的昼夜振荡表达模式，在光周期的起始阶段表达量最高，由此说明，CDFs基因在拟南芥和杨树中功能具有保守性［97］。在梨树中，PbDof9.2基因的表达受光周期和生物钟的调节，在拟南芥中异源表达PbDof9.2，通过促进PbTFL1a和PbTFL1b基因的转录，抑制开花时间调节因子FT的活性，延长转基因植株的开花时间，表明Dof转录因子在植物光周期调控开花中具有功能保守性［36］。在苜蓿中，MtCDFd1_1呈现周期性的昼夜表达模式，在黎明时转录水平达到峰值，过表达MtCDFd1_1导致苜蓿在春化条件下开花延迟，在非春化条件下开花时间不受影响，MtCO-like基因的表达没有变化；长日照诱导基因MtFTa1、MtFTb1、MtFTb2、和MtSOC1a下调表达［98］。Mtfta1和35S：MtCDFd1_1双重突变体植株的开花时间不晚于Mtfta1，表明35S：MtCDFd1_1可能通过抑制MtFTa1的表达，进而影响春化条件下的开花，MtCDFs在苜蓿光周期下通过冗余的抑制FT-like基因（尤其是MtFTa1）的表达发挥作用，但是以CO独立的光周期调控方式这与拟南芥中不同［98］。

4 Dof转录因子在毛竹中的研究进展

毛竹为禾本科竹亚科刚竹属散生竹，是竹类植物中分布面积最大，用处最广，集经济、生态、社会效益于一体的笋材两用竹种。Dof转录因子在毛竹的非生物胁迫以及开花调控中也发挥重要作用。研究表明，大部分PheDofs参与毛竹干旱、低温和高盐的响应［99］，在4℃低温和250 mmol/L NaCl处理的幼茎中，PheDof4-1诱导表达，而在20% PEG8000的根中转录水平显著下降［39］；GUS染色结果表明，PheDof12-1主要在转基因拟南芥的根、下胚轴、叶片维管束、雄蕊和花瓣中表达［100］。表达模式结果显示，PheDofs在毛竹早期花序和盛花期中表达量较高［101］，不同花发育时期转录组测序结果显示，有238个基因与毛竹开花相关，PheDofs基因在毛竹开花过程中成倍上调表达，在毛竹花发育的早期阶段高量表达［102］，干旱诱导PheDofs上调表达，促进Hd3a和MADS14基因转录，进而促进毛竹开花［103］，推测Dof-Hd3a-MADS14调控通路在毛竹开花途径中发挥关键作用［104］。原位杂交实验结果显示，PheDof1在毛竹的顶端分生组织、花序轴、颖片和苞片中表达；免疫印迹试验表明，PheDof1主要在毛竹花发育的花芽形成期、花序伸长期和盛花期中表达，这表明PheDof1参与毛竹开花［105-106］。在拟南芥中超表达PheDof12-1，导致转基因植株开花提前，开花诱导因子FT、SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）、AGL24

（AGAMOUS-LIKE24）上调表达，开花抑制SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）、FLC（FLOWERING LOCUS C）下调表达；PheDofs是节律基因，参与光周期响应，在光周期处理条件下，大部分PheDofs基因在光照的起始阶段表达量较高，在黄昏时分表达量较低，酵母单杂交结果显示，PheDof12-1可以与PheCOL4的启动子结合［100］。由此表明，PheDofs基因具有功能多样性和保守性，不仅参与非生物胁迫响应，还参与光周期调控毛竹开花。

5 展望

Dof转录因子广泛参与植物的种子萌发、碳氮代谢、非生物胁迫、开花调控等过程，表明了Dof转录因子在植物的生长发育过程中发挥重要作用。到目前为止，Dof转录因子的研究主要集中在模式植物和一年生植物中［43］，如拟南芥、水稻、番茄、大豆和玉米等。但是在多年生一次开花的毛竹中的研究少之甚少。该研究领域主要集中在毛竹笋的快速生长及激素调节等方面，在开花调控过程中，仅MADS-box、SOC1和FT基因有少量报道，其他转录因子相关报道几乎为零，并且PheDofs转录因子的靶基因尚不明确，与其他转录因子或蛋白的相互作用共同调控毛竹开花的分子机制尚不清楚，是否像其他模式植物一样通过Dof-CO-FT通路调节毛竹开花，还需要进一步研究。因此，在今后的研究中可以利用生物信息学、分子生物学和遗传学方法，探索Dof转录因子调控毛竹开花的下游靶基因及其互作蛋白，这将有助于探索毛竹开花的分子机制，为研究其调控网络提供新的思路和方法。