抗支糖浆联合糖皮质激素对咳嗽变异性哮喘模型大鼠NF-κB信号通路的影响

郭 鑫， 诸葛姝芮， 齐旭升

(湖北省十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院儿科， 湖北 十堰 442000)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一种以咳嗽为主要病症的特殊支气管哮喘，又称之为咳嗽型哮喘。临床主要症状为慢性持续性干咳，多以夜间咳嗽为主。咳嗽变异性哮喘类似于典型的哮喘发病机制，主要与致敏、气道炎症和气道重塑密切相关[1]。气道重塑会造成气道结构的改变，气道壁增厚，平滑肌增生以及炎性浸润等；研究限制抑制炎症反应可以有效改善CVA症状[2]。目前NF-κB是一种与炎性反应关系密切的信号通路分子，NF-κB信号通路广泛存在于真核细胞内，参与多种基因的调控，对细胞的增殖、分化和凋亡、组织炎症反应等起着重要作用。目前临床使用糖皮质激素可以有效治疗CVA，有学者认为糖皮质激素可以抑制炎症反应达到治疗CAV的效果，有学者认为糖皮质激素可以通过NF-κB信号通路调节细胞生物学特征实现治疗CVA[3]。但目前关于糖皮质激素治疗CVA的机制尚不完全明确。本文通过构建咳嗽变异性哮喘模型大鼠，用抗支糖浆与糖皮质激素地塞米松联合使用，研究抗支糖浆联合糖皮质激素对咳嗽变异性哮喘模型大鼠的机制，为CVA患者的治疗奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料：SD大鼠50只，购于由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022；抗支糖浆、地塞米松片分别购于重庆制药厂有限公司和广东华南药业集团有限公司。卵蛋白、氢氧化铝干粉购于美国sigma公司；β-actin、NF-κB、MMP-9和VEGF、蛋白抑制剂等(Santa Cruz公司，美国)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG(Thermo公司，美国)；细胞裂解液、ECL化学发光试剂、HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。图像采集及图像分析系统(Bio -Rad，美国)，雾化器(Boy 037G6000，德国Pari公司)DNM-9606酶标分析仪(北京朗普新技术有限公司中国)；湿转仪(AB公司，美国)；凝胶成像系统(DNR公司，以色列)，电泳仪(Bio-red，美国)，其他仪器购于德国eppendorf公司。

1.2方 法

1.2.1动物分组及模型构建：将50只SD大鼠随机分为5组，10只每组分别为：对照组、模型组、抗支糖浆组、糖皮质激素组和联合用药。对照组用生理盐水致敏(1mL腹腔注射)和雾化激发。其余四组大鼠分别于实验第1天、7d和14d腹腔注射1mL致敏溶液(10ug OVA和1mg氢氧化铝)，第21天起作为激发时间起点，大鼠放在雾化吸入箱内用雾化器雾化吸入30g/L OVA溶液5mL，3次/周，30min/次，连续激发三周；激发前30min；抗支糖浆组灌胃200uL/次；糖皮质激素组灌胃等容积量的地塞米松片1.5mg/次；联合用药组灌胃200uL的抗支糖浆和1.5mg的地塞米松；对照组和模型组灌胃等体积量的生理盐水。

1.2.2样本采集：末次哮喘激发后24h，将大鼠处死，打开大鼠胸腔，完整取出大鼠的肺用于组织蛋白提取检测或用4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，用于免疫组化分析。

1.2.3组织学检测：大鼠的肺组织经HE染色处理后，每个组织样本选择3张切片，采用美国图像采集及图像分析系统，用光笔描绘出气道基底膜的周长及平滑肌的内外分界线，测定基底膜周径(Pbm)、内管壁的面积(Wai)、支气管平滑肌的面积(Wam)；用后两个数值除以基底膜周径，用于样本组织的支气管壁厚度、平滑肌厚度。

1.2.4组织样本蛋白表达检测：肺组织用剪刀剪取小块，提取组织总蛋白，酶标仪490nm波长条件下进行蛋白定量。12% SDS-PAGE电泳分离，采用湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，4℃条件依次加入封闭液孵育2h，一抗孵育过夜(稀释比例均为1∶1000)，二抗孵育2h(稀释比例均为1∶5000)。以β-actin为内参蛋白，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统检测分析蛋白条带。

1.3统计学分析:采用SPSS12.0软件进行数据分析。对于服从正态分布的连续型资料，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间比较，当组间差异有统计学意义时，进一步采用SNK方法进行两两比较；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肺组织病理学改变：光镜下分析HE的组织染色结果，如图1所示：与对照组的气道上皮完整，无明显改变相比，模型组的肺组织及周边组织结构紊乱，气道上皮组织坏死、脱落，存在大量炎性细胞浸润，平滑肌面积增大，厚度增厚。其他治疗三组的管腔规整，气道壁及平滑肌无明显增厚，气道上皮存在少量炎性细胞浸润。

图1 各组大鼠肺组织HE染色分析(×200)

2.2图像分析检测结果:通过图像采集及图像分析系统分析各组大鼠肺组织样本的平滑肌和支气管壁厚度情况，结果如表1所示：与对照组组相比，其余4组的支气管壁和平滑肌显著增厚(P<0.05)；与模型组相比较，单独用药组和联合用药组的支气管壁和平滑肌的增厚情况明显改善，其组织厚度明显降低(P<0.05)，且联合用药组的增厚情况明显优于单独用药组(P<0.05)；而抗支糖浆和地塞米松之间统计学差异分析无意义(P>0.05)，表明抗支糖浆与糖皮质激素地塞米松的联合用药能够抑制哮喘大鼠模型的平滑肌和支气管壁增厚。

图2 westernblot蛋白分析

表1 各组大鼠支气管壁和平滑肌增厚情况

2.3westernblot蛋白表达分析：Westernblot分析各组大鼠肺组织中IκB、NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表达情况，结果如图2所示：与对照组相比，其余4组IκB表达量显著降低，模型组基本不表达IκB蛋白，NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白明显增高(P<0.05)；与模型组相比，单独用药组与联合用药组IκB蛋白表达增加，NF-κB、MMP-9和VEGF明显降低(P<0.05)；单独用药组间蛋白表达量无显著变化，联合用药组IκB表达增加量和NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表达减少量明显高于其他用药组(P<0.05)。表明抗支糖浆与糖皮质激素地塞米松的联合用药能够抑制IκB蛋白的降解，下调NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白的表达。

表2 westernblot蛋白分析

3 讨 论

咳嗽变异性哮喘又称咳嗽性哮喘，1972年Gluser首次报道了该病并命名为变异性哮喘，是指以慢性咳嗽为主要或唯一临床表现的一种特殊类型哮喘[4]。咳嗽变异性哮喘临床主要症状为慢性持续性干咳，多以夜间咳嗽为主，患者在运动后咳嗽的程度会有所加重，临床无感染，长期的抗生素治疗无效，表现出嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等增多，同时易出现气道上皮组织化；基底膜、气道平滑肌、气道壁增厚[5]。咳嗽变异性哮喘类似于典型的哮喘发病机制，主要与致敏、气道炎症和气道重塑密切相关。

抗支糖浆联合糖皮质激素可以调控NF-κB(p65)蛋白的表达以及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平，实现调控炎症反应，而炎症反应与CVA的关系密切[6]。NF-κB信号通路在机体中参与多种基因的调控，影响细胞的增殖、分化和凋亡[7]。当患者的NF-κB信号传递途径被激活以后，IκB蛋白会发生水解释放出NF-κB蛋白进入细胞核中参与对下游基因MMP9蛋白和VEGF蛋白的表达[8,9]。本文通过，研究抗支糖浆和糖皮质激素地塞米松合用对咳嗽变异性哮喘模型大鼠的影响，通过组织染色发现：联合用药与单独用药都能够显著降低模型大鼠，气道壁及平滑肌无明显增厚，气道上皮存在少量炎性细胞浸润；通过对组织的气道壁和平滑肌厚度检测发现：联合用药能够显著与单独用药组和模型组相比，均能够显著抑制肺组织的气道壁和平滑肌增厚；提取各组大鼠肺组织的总蛋白，通过westernblot分析发现，与对照组相比其余4组IκB表达量显著降低，模型组基本不表达IκB蛋白，NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白明显增高(P<0.05)；与模型组相比，单独用药组与联合用药组IκB蛋白表达增加，NF-κB、MMP-9和VEGF明显降低(P<0.05)；单独用药组间蛋白表达量无显著变化，联合用药组IκB表达增加量和NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表达减少量明显高于其他用药组(P<0.05)。

综上所述：抗支糖浆和糖皮质激素地塞米松合用，能够通过NF-κB信号通路，抑制IκB蛋白水解，降低NF-κB的释放，下调MMP-9和VEGF蛋白表达，阻止肺部气道壁和平滑肌的增厚，改善模型大鼠的哮喘症状。