维生素D调节血管内皮生长因子在支气管肺发育不良新生大鼠中的作用及机制研究

赵 婷， 王彦梅， 王 乐

(新疆医科大学第一附属医院新生儿科， 新疆 乌鲁木齐 830054)

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)在早产儿及存在呼吸系统问题的婴儿出现的风险较高。妊娠26周之前出生的婴儿中，超过70%会出现BPD[1]。组织学中BPD的特征是肺泡化不良、弹性蛋白沉积异常、纤维化、间充质细胞增生和毛细血管生长异常，但BPD潜在的发病机制尚未完全清楚，且目前尚无预防或治疗BPD的循证策略。维生素D(Vitamin D, VD)在体内骨骼代谢和矿物质稳态中通过激活转录因子维生素D受体(Vitamin D receptor, VDR)发挥关键作用。除骨骼组织，VDR在人体的许多组织中表达，包括肺、胸腺、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、抗原呈递细胞和树突状细胞等。而且VD通过影响细胞增殖和免疫功能在多种疾病(如癌症，多发性硬化症，糖尿病和心血管疾病)中发挥作用[2]。VD与先天免疫相关，而免疫相关组分同样在BPD的发病机制中被涉及到。最近的研究表明，VD及VDR不仅参与调节炎症和免疫力，还可能通过调节细胞增殖和分化相关基因，在慢性肺疾病的易感性中起重要作用[3]。VD可以作为胎儿肺发育的调节器，而且是Ⅱ型肺泡细胞和上皮细胞的生长和修复因子之一[4]。考虑到其在调节先天免疫，炎症，肺部发育和修复中的作用，因此VD和VDR可能与BPD的发病有关。发育过程中调节肺气道和血管生长的关键信号尚不完全清楚，但已知的关键信号之一为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。VEGF-A能够刺激的内皮细胞增殖，且认为其可驱动多种器官的血管生成，包括肺(发挥主要作用)。VEGF在中胚早期的血管发育中的关键作用已被证明，敲除VEGF基因甚至仅改变VEGF的单个等位基因即可破坏血管生长，甚至导致胚胎死亡。研究表明，VDR可以调节平滑肌细胞中VEGF相关信号通路，而且1,25(OH) 2 D3可通过VEGF启动子中的VD反应元件调节VEGF的生成[5]。然而VDR和VEGF在BPD中的作用仍不清楚。本研究建立BPD新生大鼠模型，研究VDR在BPD新生大鼠中的表达变化，并通过在体外改变VDR的水平讨论VDR对肺上皮细胞的功能调控及对VEGF的调节作用。

1 材料与方法

1.1试剂与耗材:SD大鼠购于新疆医科大学动物实验中心(中国，新疆)。大鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞(RLE-6TN)购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国，上海)。慢病毒包装服务和小干扰RNA试剂盒购买于上海GenePharma公司(中国，上海)。LipofectamineTM 2000试剂盒购于美国英杰生命技术有限公司(美国，加利福尼亚州)。兔抗VEGF-A、VDR(或β-actin特异性的一抗与山羊抗兔二抗均购买于美国Abcam公司(美国，马萨诸塞州)。ApopNexinTM异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒购上海碧云天生物技术公司(中国，上海)。MatrigelTM基质购于美国BD生命科学公司(美国，新泽西州)。

1.2方 法

1.2.1新生大鼠模型:本研究所有涉及动物的实验均通过我院伦理委员会的审查和批准。使用雌鼠孕21～23d自然分娩的新生大鼠。分组：新生大鼠分为BPD组(n=90)和对照组(n=10)，在12h内使用吸氧体积分数为900mL/L诱导BPD模型，对照组则呼吸空气。BPD模型制备：BPD组处理方法为：母鼠连同新生鼠置于氧箱内，持续输入O2，维持O2体积分数为900mL/L，CO2体积<5mL/L，氧箱内温度为25～28℃，湿度控制在65%。每隔24h开箱30min，添加水、粮、换垫料，并与对照组调换母鼠。空气组母鼠同新生鼠均置于空气中，具体方法和控制因素同BPD组。

1.2.2样本收集:对照组和PBD组处理24h后计为1d，将2d、5d、7d的新生鼠，每组各选择8只，用50g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，无菌取肺组织。用于VD的酶联免疫吸附测定，VDR和VEGF-AmRNA的qRT-PCR及蛋白的Western blot检测。

1.2.3细胞培养:RLE-6TN使用1640培养基进行培养，培养基中含10%胎牛血浆，细胞培养于5%CO2、湿度为37%的恒温箱。隔2d换液一次。细胞生长至对数期，我们使用10moL/L维生素D(1,25(OH) 2 D3，VD)处理2h。

1.2.4VDR过表达和敲低慢病毒的细胞感染:RLE-6TN细胞培养至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数板测出细胞密度，接种于6孔板中，每孔接种1.5×105。添加细胞培养液至2mL。16～20h后，计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在-80℃的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；用移液枪小心吸去6孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划8字的方式轻柔混匀；混匀后，细胞培养板置于37℃、5% CO2培养箱培养。待细胞长满后，传代至6孔板中，加入嘌呤霉素(3μg/mL)，连续刷选1周，所得细胞即为稳定表达细胞株。细胞慢病毒感染实验分组为正常对照组、Le-VDR组、Le-Ctrl组、Sh-VDR组、Sh-Ctrl组。其中，实验中RLE-6TN细胞感染VDR过表达慢病毒组命名为Le-VDR组，对应的过表达对照组命名为Le-Ctrl；VDR敲低组命名为Sh-VDR组，对应的敲低对照组命名为Sh-Ctrl。实验中空白对照组为未进行处理的RLE-6TN细胞。

1.2.5VEGF-A小干扰RNA合成和细胞转染:设计三个小的干扰RNA(siRNA，siVEGF-A-1，-2，-3)序列靶向VEGF-A区域，并由GenePharma公司合成。使用LipofectamineTM 2000试剂盒并根据制造商的说明进行转染。用不同的siRNA序列(600 pmoL)转染细胞，对照组为siRNA-NC，生长至融合度为50%至60%的细胞(每孔2×106个)，并在转染后48 h收获细胞。

1.2.6肺和细胞的总RNA的抽提和实时荧光定量PCR:根据制造商的说明使用TRIzol一步法从整个肺部组织(2d、5d、7d的新生大鼠)和细胞的Le-VDR、Le-Ctrl、Sh-VDR、Sh-Ctrl、siRNA-NC、siVEGF-A-1、-2、-3组中抽提总RNA。使用ND-1000紫外可见分光光度计检测260nm和280nm的光密度(OD)。测定总RNA的质量，并相调节RNA浓度。采用两步法对提取的RNA进行反转录。使用以下反应条件：70℃ 10min，冰浴2min，42℃ 60min和70℃10min。将反转录的cDNA暂时置于-80℃。qRT-PCR使用TaqMan探针法进行。Taqman引物序列，VEGF-A正-5’-TAACGATGAAGCCCTGGAGTG-3’，反5’-AGGTTTGATCCGCATGATCTG-3’；探针：5’-6～FAM～TGCCCACGTCAGAGAGCAACATCAC～Black Hole Quencher1-3’；VDR正-5’-TGACCCCACCTACGCTGACT-3’，反-5’-CCTTGGAGAATAGCTCCCTGTACT-3’;探针：5’-FAM-ACTTCCGGCCTCCAGTTCGTATGGAC-TAMRA-3’。反应条件如下：在95℃下预变性30s的一个循环，随后在95℃下进行40个循环的10s变性，在60℃下退火10s。并在70℃下延伸10s。β-actin用于内参基因。用2-ΔΔCt方法计算VDR和VEGF-A的mRNA相对表达。每个实验重复3次。

1.2.7Western blot分析:从组织或细胞样品中提取的总可溶性蛋白质(100 μg)在12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并电转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶封闭，随后用对兔抗VEGF-A(1：600)、VDR(1：500)或β-actin(1：5000)特异性的抗体进行孵育。随后将膜与山羊抗兔二抗(1：5000)进行孵育，并使用增强的化学发光法进行观察。

1.2.8免疫荧光:准备RLE-6TN细胞爬片，使用血清封闭切片后，用VEGF-A(1：600)一抗孵育(稀释比例为1:50)，与FITC偶联的山羊抗兔IgG二抗以1：200的稀释度进行孵育。最后使用Hoechst 33258复染并用共聚焦显微镜拍照。

1.2.9CCK-8检测细胞增殖:将细胞的Le-VDR、Le-Ctrl、Sh-VDR、Sh-Ctrl、siRNA-NC、siVEGF-A-1、-2、-3组细胞(每孔1×104)铺在96孔板中，并用增殖试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖。用美国BIO-RAD酶标仪读取光密度。

1.2.10流式细胞仪检测细胞凋亡:将各处理组的细胞(每孔1×105)铺在六孔板中，孵育24h后，通过ApopNexinTM异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡。在流式细胞仪(CytomicsTM FC 500)检测并分析凋亡率变化。

1.2.11伤口愈合实验分析:将各处理组的细胞(106个细胞/mL)接种到24孔塑料细胞培养板中，当细胞长成单层时，用200μL移液管吸头直线划刻该单层细胞以形成人为的划痕区域。用光学显微镜(Nikon，TE2000-S)随时间记录划痕区的表面积。拍照评估每组转染细胞中的迁移水平。

1.2.12附着力检测:在接种转染的细胞之前，于96孔板上涂5μg MatrigelTM基质(BD Biosciences，MA，美国)。温育1h后，将孔用PBS洗涤两次以除去未粘附的细胞，将其固定在低聚甲醛中，并用Giemsa染色剂染色。随后在显微镜下观察贴壁细胞，并在八个随机视野中计算每个视野的贴壁细胞数量。

1.3统计分析:数据表示为平均值±标准差。t检验用于比较符合正态分布的两组数据差异，若不符合或分布形态未知则采用U检验。差异有统计学意义，P<0.05。

2 结 果

2.1BPD肺组织中VD和VDR明显下调:评估VD和VDR在对照组和BPD组2d、5d、7d的新生大鼠肺中的表达水平，发现与对照组相比，BPD新生大鼠5d和7d的肺组织中VD(P<0.05，P<0.05)、VDR mRNA(P<0.05，P<0.05)和VDR蛋白(P<0.01，P<0.01)表达水平都降低，差异均有统计学意义(图1A-C)。

图1 Reduced levels of VD and VDR in lung tissue of BPD neonatal rats. (A) Changes in lung VD levels measured by enzyme-linked immunosorbent assay; (B) Changes in mRNA levels of VDR in lung tissues of newborn BPD rats detected by RT-qPCR; * P<0.05, compared with control group; (C) Western blot was used to detect changes in VDR protein levels in lung tissues of newborn BPD rats.

2.2体外实验观察VDR对细胞功能的影响：确定VDR失调对细胞功能的影响。RLE-6TN细胞分别感染Le-VDR、Le-Ctrl、Sh-VDR、Sh-Ctrl。Western blot结果，与Le-Ctrl组相比，Le-VDR组的VDR表达增加；与Sh-Ctrl组相比，Sh-VDR组的VDR表达降低，差异均有统计学意义(图2A,P<0.01)。CCK-8检测结果，与Sh-Ctrl组相比，Sh-VDR降低了培养细胞的增殖活力，差异有统计学意义(图2B，P<0.05)；而Le-VDR提高了培养细胞的增殖活力，差异有统计学意义(图2B，P<0.05)。此外，流式细胞术检测结果，与Sh-Ctrl组相比，Sh-VDR诱导细胞凋亡，而Le-VDR则具有相反的作用，差异均具有统计学意义(P<0.05)(图2C)。评估VDR是否有助于细胞迁移和粘附。图2D中，与Sh-Ctrl相比，Sh-VDR组迁移降低，差异有统计学意义(P<0.01)，而感染Le-VDR的细胞中细胞迁移增加，差异有统计学意义(P<0.01)。图2E中，粘附试验结果显示，与Sh-Ctrl相比，Sh-VDR组粘附能力降低，差异有统计学意义(P<0.01)。而感染Le-VDR的细胞中细胞粘附增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 VDR affects the biological function of cells. (A) Cells were infected by Le-Ctrl, Le-VDR, Sh-Ctrl, Sh-VDR, VDR protein expression in cells were tested by Western blot; (B) Cell proliferation was detected by CCK-8 method; (C) Apoptosis was measured by flow cytometry; (D) Wound healing experiments to measure cell migration levels; (E) Cell adhesion experiment was used to detect the changes of adhesion levels.

2.3VD和VDR促进VEGF-A表达:与对照组和Le-Ctrl组比较，VD处理和Le-VDR感染的RLE-6TN细胞中VEGF-A的mRNA水平上调，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.05，图3A)；VD处理和Le-VDR感染的细胞中VEGF-A的蛋白水平上调，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.05，图3B)。另外，与Sh-Ctrl组比较，Sh-VDR感染的细胞中VEGF-A的mRNA和蛋白水平下调，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.05，图3A和3B)。

图3 VD and VDR regulated VEGF-A expression. (A) The mRNA level of VEGF-A was detected by RT-qPCR; (B) The protein level of VEGF-A was detected by Western blot. * P<0.05, compared with the control group; # P<0.05, compared with Le-Ctrl; & P<0.0.5 compared with Sh-Ctrl.

2.4沉默VEGF-A抑制体外细胞的迁移和粘附能力：siRNA-NC、siVEGF-A-1、-2、-3分别转染RLE-6TN细胞，siVEGF-A-3抑制了VEGF-A的表达,差异有统计学意义(图4A，P<0.01)。免疫荧光染色法进一步证实了siVEGF-A-3抑制VEGF-A的表达(图4B)。与siRNA-NC相比，沉默VEGF-A抑制细胞的迁移能力(图4C，P<0.05)，差异具有统计学意义；与siRNA-NC相比，抑制VEGF-A还能降低细胞的粘附能力(图4D，P<0.05)，差异具有统计学意义。

图4 Effect of silencing VEGF-A on cell migration and adhesion. (A) Cells were transfected by si-VEGF-A-1, -2, -3, VEGF-A protein levels were detected by Western blot; ** P<0.01 compared with si-NC;(B) Cell immunofluorescence was used to detect the expression of VEGF-A in cells; (C) Cell migration level was measured in wound healing experiments; (D) Adhesion level changes were detected by cell adhesion experiments.

2.5VDR过表达恢复沉默VEGF-A对细胞迁移和粘附的影响：Le-VDR与siVEGF-A-3共同处理RLE-6TN细胞，与Le-Ctrl+siVEGF-A-3相比，Le-VDR+siVEGF-A-3组的VEGF-A蛋白表达部分上调，差异有统计学意义(图5A，P<0.01)；与Le-Ctrl+siVEGF-A-3相比，Le-VDR+siVEGF-A-3上调细胞的迁移能力(图5B，P<0.01)，差异具有统计学意义；与Le-Ctrl+siVEGF-A-3相比，Le-VDR+siVEGF-A-3上调细胞的粘附能力(图5C，P<0.01)，差异具有统计学意义。

图5 VDR overexpression restored the effects of silencing VEGF-A on cell migration and adhesion. (A) si-VEGF-A-3 combined with Le-VDR or Le-Ctrl were co-transfected cells, VEGF-A protein expression was detected by Western blot; (B) cell migration level was measured by wound healing experiment; (C) Cell adhesion levels were measured by adhesion experiments. ** P<0.01, compared with si-NC; ## P<0.01, compared with Le-Ctrl + siVEGF-A-3.

3 讨 论

本研究表明，BPD新生大鼠的VD、VDR、VEGF-A的水平表达均降低，而研究通过敲低VDR和沉默VEGF在体外复现了BPD模型肺泡上皮细胞的特性，这些数据暗示，改变VDR表达和VEGF可能有助于BPD的发展。

最近证据表明，VD和VDR通过调节细胞增殖、凋亡、转移从而与肿瘤发展相关[6]。与该研究类似，本研究观察到当VDR在RLE-6TN细胞中过度表达时，细胞增殖、粘附、伤口愈合能力明显增强，且细胞凋亡被抑制，然而下调VDR则有相反的作用，这表明VDR可影响肺泡上皮细胞的生物学功能。已证明VDR在细胞分化中起着至关重要的作用，尤其是对于肌细胞和成肌细胞分化的影响。此外，VDR与慢性阻塞性肺病具有相关性[7]。VDR可协调神经和气道平滑肌发育[8]。我们同样发现异常表达的VD和VDR与BPD相关，表明VD可能通过活化/诱导VDR的表达从而调节肺上皮细胞的功能。

细胞迁移和粘附作用和细胞外基质(ECM)的异常重塑均与BPD的发病机制有关[9]。随着BPD的发展，与迁移、粘附、ECM重塑、纤维化相关的基因功能失调，这些基因包括转化生长因子-β1(TGF-β1)、胶原蛋白-1α、金属蛋白酶1(TIMP-1)。VEGF对血管生成具有关键作用，是调节肿瘤细胞粘附和转移关键分子。本研究发现敲低VEGF-A抑制肺上皮细胞的伤口愈合及粘附作用，这与以往研究一致，而且VEGF-A的表达在BPD新生大鼠的肺组织中均下调。说明VEGF-A是潜在的BPD调节基因之一。

另外，研究表明VD通过VDR介导VEGF生成，VEGF和血小板源性生长因子受体信号转导共同调控血管生成活性，表明VEGF信号可能是VD发挥一系列功能的下游靶点[8]。VEGF是早期血管发育的关键因子，VEGF基因缺失可抑制内皮细胞增殖破坏血管生长，甚至导致胚胎死亡。可见，VEGF在组织发育过程中扮演关键角色。重要的是，已证实VD能通过促进VEGF启动子中的VD反应元件从而调节VEGF生成[5]。本研究同样证明BPD肺组织中VD及VDR的表达降低，而且体外证实VD和VDR均可以促进肺上皮细胞中VEGF-A的表达。说明VD和VDR可能通过上调VEGF-A从而调节肺上皮细胞的粘附和迁移能力。我们进一步的验证实验发现VDR过表达可改善因敲低VEGF-A对肺上皮细胞的粘附和迁移的抑制作用。而且敲低VEGF-A表达还可以被VDR过表达部分恢复。因此，VD和VDR可能通过调节VEGF-A可能参与BPD的发展。

综上所述，本研究表明，由于VD和VDR下调导致的VEGF-A水平降低在BPD新生大鼠肺上皮细胞功能和ECM重塑中起着至关重要的作用。本研究的结果初步建立一种VD和VDR介导VEGF-A功能调节BPD发病的机制，有助于拓展BPD疾病的潜在基因治疗方法。本研究成果仍需在体内实验中进一步深入探究。