基于网络药理学的防己茯苓汤治疗急性肾损伤机制研究❋

李美丹，姚 兰，梁群卿，黄李冰雪，钟 婵，郭华慧，王 玮，刘雪频，黄仁发

(1. 广西中医药大学研究生学院，南宁 530001； 2. 广西中医药大学附属瑞康医院健康体检中心，南宁 530011； 3. 广州中医药大学深圳医院肾内科，广东 深圳 518034)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)指各种原因引起肾功能在短时间内迅速恶化，导致水电解质、酸碱平衡紊乱和含氮产物聚积的一组综合征[1]。流行病学显示，全球每年约1330万住院患者发生AKI，约170万死于AKI及其并发症；中国危重症患者AKI发生率达30.0%～50.0%，死亡率为16.7%[2]。临床上主要从保护肾单位、纠正酸碱平衡及电解质紊乱等方面治疗AKI，目前尚缺乏特效药[3]。近年来，急性肾损伤药物治疗的相关研究成为医学界的热点。防己茯苓汤源自张仲景《金匮要略》：“皮水为病，四肢肿，水气在皮肤中，四肢聂聂动者，防己茯苓汤主之。[4]”全方由防己、茯苓、黄芪、桂枝、甘草5味药组成，具有利水消肿、通阳益气之功，是脾虚水肿证的基础方。研究表明，防己茯苓汤通过抑制肿瘤坏死因子诱导后系膜细胞的增殖及增加基质金属蛋白酶-2(matrix meta-lloproteinase-2，MMP-2)的表达来治疗AKI[5]。但防己茯苓汤的具体作用机制及相关通路如何目前尚未明确。网络药理学作为一种新兴的研究理念和方法，通过融合多学科的技术和内容，从整体角度构建疾病-药物-靶点网络，探究疾病与药物间的关联性，其研究方法与中医整体观念不谋而合[6-7]。因此，本文以防己茯苓汤为研究对象，通过网络药理学方法构建药物活性成分-靶点网络，进一步探究对AKI治疗的作用机制，为临床应用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 防己茯苓汤的化学成分

本研究依据网络药理学分析技术平台(TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以防己、茯苓、黄芪、桂枝、甘草5味中药为检索词，检索防己茯苓汤中药物组成的所有化学成分。

1.2 药物的活性化合物及靶点的筛选

口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是药物代谢动力学最重要的参数之一，其涉及药物的吸收、分布、代谢和排泄，其表示口服药物经胃肠道消化吸收，经过肝脏最后到达体循环血液中的药量占口服剂量的百分比[8]。类药性(drug likeness，DL)指化合物与已知药物的相似性。本研究借助TCMSP数据库，筛选出防己、茯苓、黄芪、桂枝、甘草所有化学成分中符合OB≥30%和DL≥0.18的活性化合物。利用Pub Chem(https: // pubchem．ncbi．nlm．nih．gov /) 获得各化合物SMILES,将各化合物SMILES 导入Swiss Target Prediction 数据库(http: //www．Swiss target prediction．ch /)获取化合物所对应的靶点。

1.3 化合物-靶点网络的构建

使用Excel将防己茯苓汤的化合物和靶点构建成化合物-靶点对应关系，经去重后将Excel文件导入Cytoscape 3.7.1软件构建可视化的化合物靶点图，以探究防己茯苓汤的药理学作用机制，并进行网络拓扑学结构分析。

1.4 AKI疾病靶点的筛选

通过在CTD(http: // ctd. mdibl. org /)数据库中输入关键词“acute kidney injury”，搜索AKI的疾病靶点，经整合、处理、去除假阳性基因后选取推论分数较高的靶点并保存。

1.5 活性化合物靶点与AKI疾病靶点的Venn分析

将防己茯苓汤药物中经去重后的活性化合物靶点与CTD数据库筛选出的AKI疾病靶点进行维恩(Venn)分析，得到共同的靶点集并形成可视化的Venn图，以显示中药复方活性成分与AKI的靶向关系。

1.6 构建蛋白相互作用网络(PPI)

为更好地阐明防己茯苓汤治疗AKI靶点蛋白在系统水平上的相互作用，将“1.5”项得到的共同靶点集导入在线STRING(https://string-db.org/)数据库，将蛋白来源设置为“Homo sapiens”(人类)进行操作，并选取评分条件大于0.90的高置信度数据，以隐藏图中孤立的蛋白，最终导出可视化的PPI网络图。

1.7 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析与KEGG通路富集分析

为进一步探究防己茯苓汤治疗AKI靶点集在基因功能和信号通路中的作用，本研究利用DAVID 6.8数据库(https: //david. ncifcrf. gov /)对“1.5”项得到的靶点集进行GO功能富集分析与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。将“1.5”项获得的靶点集复制到DAVID平台的通用管理板中，将“Select Identifier”设定为“Official Gene Symbol”，“List Type”设定为“Gene List”，同时将平台中的“List与Background”都设定为“Homo Sapiens”提交列表得出GO功能富集分析与KEGG通路富集分析结果。对GO结果绘制可视化的条形图，通过Omicshare 平台制作KEGG通路气泡图。

2 结果

2.1 防己茯苓汤活性化合物及靶点的筛选

表1示，基于数据库构建方法，从TCMSP数据库中检索防己茯苓汤全方防己、茯苓、桂枝、黄芪、甘草所有化学成分，共获得671种活性化合物，其中防己50种，茯苓34种，桂枝220种，黄芪87种，甘草280种。以OB≥30%和DL≥0.18的条件进行筛选，最终得到候选活性化合物共137种，其中防己3种，茯苓15种，桂枝7种，黄芪20种，甘草92种。将候选化合物去重后得到127种。经Swiss Target Prediction数据库可获得所有化合物所对应的靶点共2041个，去重后可得273个靶点。

表1 防己茯苓汤127种化合物信息比较

2.2 防己茯苓汤活性化合物-靶点相互作用网络

图1示，利用127种化合物与273个靶点的关系，将数据导入Cytoscape 3.7.1软件，绘制防己茯苓汤活性化合物-靶点相互作用网络图。在化合物-靶点网络图中，防己茯苓汤活性化合物分子用中间所示的矩形节点代表，靶点蛋白用外周两圈的节点表示，边表示化合物分子与靶点蛋白相互作用关系，共400个节点(127个化合物分子节点与273个靶点蛋白节点)和2041条边。在网络中，一个节点的度值(Degree)表示连接该节点路线的数量，数量越多节点越大，即度值与节点的大小呈正相关。中介中心性表示网络中某节点连接2个节点之间最短路径的次数，次数越多表示该节点在网络中越关键。该网络拓扑学结果显示，节点平均Degree值为10.205，共有192个节点大于平均Degree值；节点平均中介中心性为0.00595279，共有102个节点大于平均中介中心性。根据网络中Degree值、中介中心性及平均中介中心性所得结果，筛选出Degree值较大、中介中心性高的核心节点进行分析，这些连接较多化合物或靶点的节点在整个网络中起到纽带作用，可能是重要的化合物或靶点。在该网络中，每个化合物平均对应17个靶点，每个靶点平均与8个化合物相互作用，因此防己茯苓汤中存在一个化合物与多个靶点之间的相互作用，同时也存在不同化合物协同作用于同一个靶点的现象，这体现了中药多成分与多靶点之间相互作用的机制，符合中药复方的机理。通过对化合物分析，作用靶点≥15个的化合物占88%，其中有10个化合物的作用靶点≥26个；Degree值排名前3位的化合物分别为β-谷甾醇(MOL000358)、常春藤皂苷元(MOL000296)、谷甾醇(MOL000359)，都与30个靶点蛋白发生相互作用。从靶点的角度，Degree值排名前3位的靶点为MAPT、TDP1、PTPN2，分别与97、76、53个化合物发生相互作用。

注：中间矩形节点代表化合物，外围两圈节点代表靶点，节点的大小与节点的度呈正相关图1 防己茯苓汤化合物-靶点网络

2.3 筛选AKI疾病靶点

在CTD数据里共收索到57059个AKI疾病靶点，选取推论分数值较高的靶点并结合文献挖掘数据的方法收集基因，经整合去重后共得到496个疾病靶点，如TNF、BAX、NOS2、TGFB1等。

2.4 化合物靶点与AKI疾病靶点Venn分析

图2示，将防己茯苓汤中273个化合物靶点与AKI中496个疾病靶点进行Venn分析，得到共同的基因集共58个靶点，如PTGS1、RELA、HMGCR、CYP1A2等。

图2 化合物靶点与疾病靶点Venn图

2.5 防己茯苓汤靶点PPI网络的构建与分析

图3、4示，为进一步研究防己茯苓汤的作用机制，本研究基于蛋白互作关系，使用STRING数据库，对“2.4”项得到的58个基因集构建了防己茯苓汤PPI网络图。经置信度设置为>0.90后得到PPI网络包含58个靶蛋白节点，100条表示靶标蛋白之间作用关系的边。根据节点的Degree绘制出前10个关键靶蛋白节点的柱形图。Degree排名前4的靶蛋白为SRC蛋白(SRC)、人源重组蛋白(HSP90AA1)、细胞核因子kp65蛋白(RELA)、蛋白激酶(AKT1)。其中Degree值较高的靶点蛋白是SRC蛋白(Degree=15)，说明在PPI网络中SRC蛋白发挥关键作用，成为网络中其他蛋白节点相互连通的纽带。

图3 防己茯苓汤靶蛋白PPI网络

图4 PPI网络中的关键靶蛋白

2.6 GO富集与KEGG通路富集分析

图5～7示，为阐明防己茯苓汤治疗AKI的生物学功能，使用DAVID数据库对“2.4”项筛选出的58个基因进行GO和KEGG分析。GO分析是一种基因功能分类体系，能够衡量多个物种的基因功能，它分别从生物学过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组件(Cellular Com-ponent，CC) 3个不同层面对靶点基因进行功能定义分析。通过GO分析显示，BP、MF、CC所查到的条目分别为201个、76个、28个，根据Benjamini校正法筛选P<0.01的GO条目，经校正后分别得到BP条目28个，MF条目25个，CC条目5个，并分别绘制条形图。由图可知，BP值靠前的有一氧化氮生物合成过程(GO:0006809)、负调控凋亡过程(GO:0043066)和缺氧反应(GO:0001666)；MF中血红素结合(GO:0020037)所占比例最大，其次为ATP酶活性与物质跨膜运输(GO:0042626)；在CC中，防己茯苓汤活性成分作用的靶点主要富集在细胞质核周区(GO:0048471)和蛋白质复合物(GO:0043234)。KEGG富集分析通过查找靶点蛋白在通路中的分布情况，以进一步了解该蛋白在不同通路中发挥的作用。经KEGG分析共得到62条信号通路，将信号通路的相关数据导入Omicshare 平台，得到靶蛋白排名前20的通路气泡图(图8)。图中气泡大小表示该条通路富集到的靶点数量，气泡颜色的深浅表示靶蛋白在该条通路富集程度的高低。富集靶点数量多且富集程度高的通路是雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、癌症通路(Pathways in cancer)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、胆汁分泌(Bile secretion)、癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)。

图5 靶点GO-BP富集分析

图6 靶点GO-MF富集分析

图7 靶点GO-CC富集分析

图8 防己茯苓汤相关靶点KEGG富集气泡图

3 讨论

AKI是一种临床上常见的危急重症，其病理生理机制复杂。目前对其机制的研究主要集中在肾血流动力学改变、免疫炎症反应、基因多态性及细胞凋亡等方面，其中以肾血流动力学改变贯穿始终[9]。AKI在中医中未有确切病名，但就其水肿、无尿、少尿等临床表现属于“水肿”“癃闭”“关格”“溺毒”等范畴。中医认为AKI的发生多与外感六淫邪毒、内伤情志、瘀浊内蕴、久病体虚、药毒中伤等因素有关。其病机以本虚标实为主，发病机理责于肺脾肾三脏功能失司。防己茯苓汤是《金匮要略》治疗水气病的经典要方，该方现代临床应用广泛，主要用于慢性肾炎性水肿、急性肾损伤、心脏病性水肿、肝硬化腹水、下肢静脉血栓性水肿等疾病的治疗[10-11]。研究表明，防己茯苓汤能够降低β2-微球蛋白、Cys C水平来治疗AKI且疗效显著[12]。苏中昊等实验研究指出，防己茯苓汤通过抑制KIM-1和NGAL蛋白的表达来防治AKI[13]。现代药理研究表明，在防己茯苓汤中，防己含有多种生物碱，具有抗肾间质纤维化、抗炎、降压、松弛平活肌等作用[14]；茯苓中的多糖类作为醛固酮受体拮抗剂而发挥利尿作用，同时还能消除氧自由基，提高机体免疫[15]；桂枝中的桂皮醇能够利尿消肿、解热镇痛和消除炎性肿胀等[16]；黄芪中的皂苷类及黄酮类通过促进组织修复，防止肾小管坏死，降低血肌酐及尿素氮水平等来防治肾损伤[17]。而防己茯苓汤发挥抗AKI的具体作用机制如何，是否与化合物作用于该疾病的靶点，或者参与信号通路的调控有关，目前未见相关的研究及报道。

网络药理学是在现代药理学研究的基础上，以系统生物学研究手段，对疾病和药物之间的作用机制进行系统网络分析。本研究通过网络药理学技术，依托化合物、靶点蛋白、疾病和生物信息等多个数据库，构建化合物靶点疾病网络并进行靶点及通路的富集分析，深入探究传统经方防己茯苓汤防治AKI的作用机制。经药物的化学成分分析，共收集到127种活性化合物及对应靶点273个，经生物利用度筛选，得到与化合物关系密切的靶点有异黄酮、甘氨醇、三羟基-5-甲氧基-3-芳基香豆素、地衣吡喃香豆素、菜豆酚等。对防己茯苓汤靶点和AKI靶点进行PPI网络构建，并分析其网络构建结果得出与AKI联系密切的靶点。如中性粒细胞脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子-1(KIM-1)、SRC蛋白(SRC)、蛋白激酶(AKT1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等。中性粒细胞脂质运载蛋白(NGAL)在AKI中意义显著，研究表明在AKI患者中，尿NGAL水平在肌酐水平上升之前已显著升高，故NGAL可作为AKI早期监测的生物学标志物[18]。GO富集分析结果表明，防己茯苓汤对AKI的防治主要在一氧化氮生物合成、负调控凋亡、缺氧反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程中发挥作用；在分子功能上，通过血红素结合、ATP酶活性与物质跨膜运动、类固醇激素受体活性等参与；在细胞组件中，通过细胞质核周区、蛋白质复合物、细胞器膜等来体现。KEGG富集分析结果显示，防己茯苓汤治疗AKI涉及血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)信号通路、低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)信号通路、雌激素信号通路和癌症信号通路等。研究表明，肾组织在缺血缺氧的环境下HIF-1α表达水平持续升高，并进一步介导其下游对缺氧敏感的VEGF蛋白的活化，使VEGF蛋白表达增加进而影响肾小球基底膜的电荷屏障，使肾小球滤过膜的通透性增加，血浆蛋白滤过增多，从而导致尿蛋白并参与AKI的发生发展[19]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对防己茯苓汤经方多成分、多靶点、调控多条信号通路与AKI的关系进行研究。研究结果初步揭示了防己茯苓汤防治AKI的药理学作用及相关机制，为进一步深究其潜在的作用机制及临床运用奠定了良好基础，为AKI的治疗提供了新的思路。但本研究也存在一定的局限性，在研究途中未考虑药物的用量、煎煮方式以及药物在体内的代谢情况等因素的影响，因此所得结果尚需更深入的研究与探讨。