泻肝安神方调节血清与杏仁核炎症反应改善肝郁火化证焦虑大鼠行为学的实验研究❋

赵振武，郭蓉娟，顾丽佳，史华伟，邓潇斐，郭 晓，袁清洁，郭建友

(1. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078； 3. 中国科学院心理研究所，北京 100101； 4. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700； 5. 北京市中西医结合医院，北京 100096)

焦虑症是临床常见神经症亚型，已成为突出的公共卫生问题。西药治疗广泛性焦虑障碍(GAD)效果肯定，但部分患者因不良反应求助于中医药。先前专家采用临床流行病学方法，在多中心、大样本量基础上运用贝叶斯网络技术和聚类分析方法明确肝郁化火是GAD的六大基本证型之一[1]。郭蓉娟等认为疏肝泻火养血安神法是符合此证的常用治法[2]，方随法出，由静心安神汤化裁成泻肝安神方[3]，其疗效好、不良反应少、服用方便，但效应机制有待阐明。

心理生理学理论认为，焦虑是遗传与环境因素作用的产物，相关因素还包括营养过剩、氧化应激和炎症[4]。特别是应激性焦虑，炎症是公认一致的因素[5]和潜在病因[6]。发现炎症和精神疾病的新途径之后[7-8]，外周免疫系统和大脑之间的相互作用被持续评估[9]。其中促炎细胞因子依然是调节心理神经免疫学的主要生物活性物质[10]。公认影响行为的2种外周炎症细胞因子为IL-1β和TNF-α[11-12]，而抗炎细胞因子未被揭示。基于此，本研究进一步探讨泻肝安神方对肝郁化火焦虑大鼠行为学及血清和杏仁核炎症因子的影响，明确焦虑的免疫调控失常情况及泻肝安神方效用环节。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康8周龄雄性Wistar大鼠120只，体质量(200±10) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK (京) 2012-0001。饲养于中国科学院心理研究所动物房，室温控制在20～24 ℃，相对湿度50%～60%，光照节律12 L/12D (7∶00～19∶00)，提供充足饲料和水，保持安静，定期清洁和消毒。预养1周内自由摄食饮水，每天接受3 min抚摸。

1.2 药品与仪器及试剂

泻肝安神方组成：炒枣仁、刺五加、夏枯草、羚羊角粉，由北京康仁堂药业有限公司提供，配方颗粒由北京中医药大学东方医院制剂室质量控制。盐酸地西泮片，2.5 mg/片(北京益民药业有限公司生产，国药准字H11020898)。

AES-M02 型大鼠高架十字迷宫，安来软件科技有限公司Experimental System实验系统和Behavioral Software行为分析软件V-Maze ver 1.0；XeyeAbaV3.2动物行为视频分析系统，北京天鸣宏远科技发展有限公司；明暗箱参照文献方法[13]自制；EZStart Chromatography Data software；5415R型高速离心机，德国Eppendorf公司；JY99-IIIB型超声波细胞破碎仪，宁波新芝科器研究所；Lambdal P40紫外可见光分光光度仪，美国PE公司。

2 方法

2.1 分组

适应性饲养7 d后根据高架十字迷宫测试结果均分成空白对照组、模型组、地西泮组、泻肝安神方高、中和低剂量组各20只，组间行为学测试差异无统计学意义。应激第7天、14天每组随机取10只进行行为学评估和取材检测炎症因子。

2.2 动物模型建立

依据林文娟和前期的经验[14-15]，采用高架十字迷宫(elevated plus maze test，EPM)任务进行定期评估，除空白对照组外，其余各组单笼饲养且按照设定实验程序给予不确定性空瓶饮水应激建立肝郁化火焦虑模型。定时喂水训练7 d，早晚各给饮水10 min，其余时间不给水。于第8天晚21∶00～21∶10开始应激实验，早晚2个时间段内给予随机刺激，持续2周，造模同时药物干预连续14 d。空白对照组定时自由摄食。应激第7天及第14天行为学测评，组间交叉进行。动物均提前2 h进入测试实验室适应环境。

2.3 给药方法

参考《药理实验方法学》，泻肝安神方高、中、低剂量组分别以28、14、7 g·kg-1·d-1颗粒剂混悬液灌胃，地西泮组以4.5 g·kg-1·d-1混悬液灌胃，每天1次，连续14 d。其余2组给药时间和途径同前，以0.9%氯化钠溶液代替药液。

2.4 高架十字迷宫试验

中药各组给药1 h后，地西泮组给药0.5 h后，在8∶00～14∶00进行行为学测试。测试时将大鼠置于高架十字迷宫的中央区，头朝开臂，红外跟踪记录5 min内大鼠进入开臂与全程的运动路程和开臂内停留时间(以四肢全部入臂或出臂为标准)。以开臂与全程运动路程的百分比、开臂内停留时间与5 min的百分比作为抗焦虑的观察指标。

2.5 旷场实验

测试时，将单只大鼠放入清洁敞箱的边缘区，视频跟踪分析系统自动记录大鼠5 min 自发活动。动物运动轨迹跟踪系统统计全程运动路程和中央区(内半径33 cm的圆形区域)的停留时间。

2.6 明暗箱实验

实验开始时将大鼠置于明箱中央，头朝暗箱，记录5 min内进入明箱次数及停留时间。

2.7 炎症因子测定

血清和脑组织杏仁核制备，-80℃冻存。将脑组织放在冰上，采用RIPA裂解液提取脑组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，-80℃冻存。

以酶联免疫吸附法(ELISA)测定外周血清和杏仁核中的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及白介素-10(interleukin-10，IL-10)的含量，试剂购买于美国R&D公司，仪器为美国ThermoMultisk 3型酶标仪。按照试剂盒操作步骤执行。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 高架十字迷宫实验、旷场实验、明暗箱测试

表1～3示，第7天与空白对照组比较，模型组开臂运动路程百分比及停留时间百分比降低，运动路程增加，明区停留时间百分比减少(P<0.05)，14 d时改变显著，进入明箱次数及明区停留时间百分比减少(P<0.01)；第14天与模型组比较，地西泮组开臂运动路程百分比及停留时间百分比升高，运动路程减少和中央区停留时间增加，进入明箱次数和明区停留时间百分比增加(P<0.05)；泻肝安神高剂量组开臂停留时间百分比明显升高，运动路程减少，进入明箱次数增加(P<0.05)，明区停留时间百分比显著增加(P<0.01)。

表1 各组高架十字迷宫测试行为学比较[例(%)]

表2 各组旷场测试行为学比较

表3 各组明暗箱测试行为学比较

注：与空白对照组比较：▽P<0.05，▽▽P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01图1 各组血清炎症因子比较

3.2 血清炎症因子

图1示，应激第7天与空白对照组比较，模型组IL-1β、TNF-α含量均增加(P<0.05)，第14天IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著增加(P<0.01)，IL-10含量显著减少(P<0.01)。应激第14天与模型组比较，地西泮组IL-6、TNF-α含量均显著减少(P<0.01)， IL-10显著增加 (P<0.01)；泻肝安神高剂量组减少IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，显著降低TNF-α含量(P<0.01)，增加IL-10含量(P<0.05)。

3.3 杏仁核炎症因子

图2示，应激第14天与空白对照组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α均明显增加，IL-10含量显著减少(P<0.01)。与模型组比较，地西泮组IL-6、TNF-α均显著减少，显著增加IL-10含量(P<0.01)；泻肝安神高剂量组IL-1β、TNF-α减少， IL-10 增加(P<0.05)，在IL-6上中剂量组优于高剂量组。

注：与空白对照组比较：▽▽P<0.01；与模型组比较：*P<0.05图2 各组杏仁核炎症因子比较

4 讨论

焦虑障碍人群终身患病率为13.6%～28.8%[16]，近年来呈上升趋势，造成医疗资源的沉重负担，导致自杀等严重社会问题。因此探索焦虑障碍的产生机制，寻求有效的药物治疗途径已成为当前迫切需要解决的课题。中医证型以气郁化火多见，病位主要在肝心涉及脾肾，主要病机为肝气郁而化火、耗伤阴血、血不养心、心神不宁致病[2]。治疗以疏肝解郁、清肝泻火、养血安神为主。泻肝安神方是北京中医药大学东方医院郭蓉娟教授的经验方，疗效与帕罗西汀片相当[17-18]，具体机制值得探讨。

本课题重复前期实验采用不确定性空瓶饮水应激仿照慢性焦虑情绪应激方式[15]，模拟郁怒日久化火的病理演变过程，通过行为学观察及饮水量、体质量、爪红r值比较以及以方测证佐证情绪应激14 d成功建立肝郁化火焦虑模型。以此为基础，酶联免疫吸附法(ELISA)测定外周血清和杏仁核中炎症因子含量，探讨焦虑症的发病机制。应激14 d模型组较少进入及停留于开放臂中，旷场运动总路程增加，而中央区停留时间减少，进入明箱次数减少且停留时间显著缩短，结合前期实验表明模型成功建立。

近年来，一些研究趋向于精神疾病发生可能与免疫激活导致细胞因子分泌增多有关，即“细胞因子假说”[19]。本研究示模型组应激1周血清IL-1β和TNF-α含量略增加， 2周时TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高，IL-10含量降低，即出现炎症。杏仁核是调节动物情绪的核心区域，在焦虑症发生过程中起决定性的作用[20-22]，炎症因子结果与血清类似。应激导致促炎细胞因子释放增加，抗炎因子被抑制，引起机体炎症反应，泻肝安神方可使炎症反应趋向正常化。本方由炒枣仁、刺五加、夏枯草、羚羊角粉4味药物组成，虚实兼顾，气血并用，配伍精当，方小力专，共奏疏肝泻火、养血安神之功，疗效与调节炎症有关。

焦虑与免疫功能的异常改变关联。异常免疫状态可引发焦虑[23]，焦虑患者存在免疫功能的改变[24]。GAD患者可能同时存在免疫功能的激活及抑制，表现为免疫功能紊乱[25]。细胞因子参与调节情绪和行为，在焦虑等精神疾病中发挥作用[26]。本研究第14天模型组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著增加，抗炎因子IL-10含量明显减少，即促炎因子和抗炎因子的平衡被打破，出现免疫功能紊乱，与临床报道一致。地西泮与泻肝安神方均能减少IL-6、TNF-α和增加IL-10含量，为共性抗焦虑机制。另外本方还能减少IL-1β含量，作用机制更广。本方究竟是直接作用于免疫系统，或是通过中枢系统的作用进而引起免疫功能改变，其抗焦虑的物质基础未明，有待进一步探讨。